 摘 要：目的 以具有抗老年痴呆作用的石菖蒲挥发油为模型药物，制备石菖蒲挥发油鼻喷微乳。方法 根据石菖蒲挥发油在各溶媒中的溶解度初步确定微乳处方组成，并通过绘制伪三元相图，通过比较微乳区域大小、稳定性、载药量等优选最优处方。结果 优选最优处方为石菖蒲挥发油-Cremophor EL-丙三醇-水（6.25∶20.83∶10.42∶62.5），平均粒径为（30.5±0.2）nm，多分散系数（PDI）为0.150±0.002，黏度（2.80±0.21）mPa∙s；以β-细辛醚计，体外透皮速率为（1288.76±16.20）μg/(cm2∙h)，比石菖蒲挥发油普通乳透皮速率提高了14倍；蟾蜍纤毛毒性实验显示该制剂无显著毒性。结论 所制得的石菖蒲挥发油鼻喷微乳理化性质稳定，透皮性能好，对鼻黏膜纤毛毒性低。  老年性痴呆症包括阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease，AD）、脑血管性老年痴呆及混合性痴呆，是继心脏病、肿瘤和卒中之后排在第4位的导致死亡的疾病[1-2]。随着我国老年人口的增多，其发病率呈上升趋势，给患者个人、家庭及社会带来了巨大的负担[3-5]。石菖蒲具有化痰开窍、醒神益智等功效，临床上广泛应用于癫痫、健忘、老年性痴呆等疑难病症[6-7]。药理学研究表明，石菖蒲挥发油是其主要活性部位，活性成分为α-、β-、γ-细辛醚[8-10]。石菖蒲挥发油能减轻脑缺血-再灌注时对神经元的损害、抑制神经细胞凋亡等可能是其治疗老年痴呆作用机制[7,11-12]。目前，临床使用石菖蒲类制剂多为复方汤剂、片剂、丸剂等传统制剂，服用剂量大，存在肠道毒副作用，药物难以透过血脑屏障，生物利用度低，需对药物进行二次开发[13]。 鼻喷剂通过鼻腔给药，鼻黏膜微绒毛表面积大、通透性高，可以更好地吸收；鼻腔给药，药物通过嗅神经通路、嗅黏膜上皮通路可直接吸收进入脑组织[14]。因此，通过鼻腔给药可以使不易透过血脑屏障的药物实现脑靶向性[15]。 微乳是各项同性的热力学稳定载药系统，对难溶性成分有较好的增溶性，提高药物的稳定性，促进药物透皮吸收，提高药物生物利用度，且制备工艺相对简单，适宜工业化大生产[16-18]。 本研究将具有保护中枢神经系统和抗老年痴呆作用的石菖蒲药效部位挥发油制备成鼻喷微乳制剂，并对新制剂的理化性质和体外透皮性能进行考察。解决目前石菖蒲药物稳定性差、肠道毒副作用、难以透过血脑屏障进入大脑中枢神经系统发挥神经治疗作用等问题，提高药物的生物利用度，增强疗效，为临床治疗老年痴呆提供一种新的高效、低毒、安全方便的中药制剂石菖蒲挥发油鼻喷微乳奠定基础；并为微乳作为新型药物载体在中药经鼻腔给药系统的靶向性研究提供实验依据。 1 仪器、试药与动物 丹东百特BT-90纳米激光粒度仪，丹东百特仪器有限公司；Agilent 1200型高效液相色谱仪，包括四元泵洗脱系统、自动进样器、在线脱气装置、柱温箱及光电二极管矩阵检测器，美国Agilent公司；VORTEX 4涡旋振荡器，上海达姆实业有限公司；DDS-307A电导率仪，上海仪电科学仪器股份有限公司；G220透射电子显微镜，荷兰FEI公司。 β-细辛醚对照品，广东食品药品职业学院自制，HPLC峰面积归一化法测得质量分数为99.21%；石菖蒲，批号201712130812，购自广州致信药业有限公司，经广东食品药品职业学院梁永枢副主任中药师鉴定为天南星科植物石菖蒲Acorus tatarinowii Schott的干燥根茎；石菖蒲挥发油，广东食品药品职业学院自制，其中β-细辛醚含量质量分数为37.33%；聚氧乙烯蓖麻油（Cremephor EL，CEL）、聚氧乙烯氢化蓖麻油（Cremephor RH 40，RH40），德国BASF公司；烷基酚聚氧乙烯醚（OP10乳化剂），广州市德田新材料有限公司；聚乙二醇200（PEG200）、PEG400、异丙醇、丙二醇、丙三醇、去氧胆酸钠、无水乙醇均为分析纯，购于广州化学试剂厂；液相用甲醇、乙腈、乙醇为色谱纯，水为重蒸水。 中华大蟾蜍，雄性，体质量35～40 g，广州中医药大学实验动物中心提供，实验动物许可证号SCXK（粤）2013-0020。 2 方法与结果 2.1 石菖蒲挥发油制备 参照文献报道[19]，采用超临界CO2萃取方法（以占萃取物0.08 mL/g的乙醇为夹带剂，萃取压力22.5 MPa，萃取温度43 ℃，萃取时间126 min，CO2体积流量16 L/h，解吸压力4.0 MPa，解吸温度25 ℃）制得石菖蒲挥发油，其中β-细辛醚质量分数为37.33%，备用。 2.2 β-细辛醚HPLC法定量测定 2.2.1 色谱条件 色谱柱为EclipseXDB-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-水（65∶35）；柱温30 ℃；体积流量1.0mL/min；检测波长253 nm，进样量10 μL。理论塔板数以β-细辛醚计不少于3 400。 2.2.2 对照品溶液制备 精密称取β-细辛醚对照品适量，至棕色量瓶中，加甲醇定容，制成β-细辛醚质量浓度为68.27 μg/mL的溶液，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得对照品溶液。 2.2.3 供试品溶液制备 精密吸取1 mL石菖蒲挥发油至10 mL棕色量瓶中，加甲醇定容，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得供试品溶液。 2.2.4 线性关系考察 精密吸取β-细辛醚对照品溶液1、5、10、15、20 mL，分别置于20 mL量瓶中，加甲醇至刻度摇匀，备用。精密吸取上述对照品溶液各10 μL，进样，记录色谱图，测定峰面积，以峰面积（Y）对进样量（X）进行线性回归，得回归方程Y＝72 861.83 X－561.70，r＝0.999 99，结果表明β-细辛醚在68.27～1 365.40 μg，峰面积与进样量呈良好线性关系。 2.2.5 精密度试验 精密吸取上述对照品溶液各10 μL，按“2.2.1”项色谱条件，重复进样6次。结果β-细辛醚峰面积的RSD为0.15%，表明仪器精密度良好。 2.2.6 稳定性试验 分别于0、0.5、1、3、6、12 h精密吸取10 μL供试品溶液进样测定，结果β-细辛醚峰面积的RSD为1.23%，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。 2.2.7 重复性试验 分别取6份石菖蒲挥发油样品，照“2.2.3”项方法制得6份供试品溶液，照“2.2.1”项色谱条件分别进样10 μL，结果β-细辛醚质量分数的RSD为0.93%，表明该方法重复性良好。 2.2.8 加样回收率试验 精密量取已测定β-细辛醚含量的石菖蒲挥发油共6份，分别加入一定量已知质量浓度的对照品溶液，照“2.2.3”项方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项色谱条件测定β-细辛醚含量，计算回收率，结果平均回收率为99.81%，RSD为0.75%，表明本方法β-细辛醚具有较好的加样回收率。 2.2.9 样品定量测定 按“2.2.3”项方法制备供试品溶液，依照“2.2.1”项色谱条件进样，测定β-细辛醚峰面积，计算出样品中β-细辛醚的含量。结果样品中β-细辛醚质量浓度为（413.13±1.57）μg/mL（n＝3）。 2.3 微乳处方的筛选 2.3.1 油相（O）的确定 微乳的油相一般选用较短链（C8～C18）的油，因为短链油容易嵌入表面活性剂中，易形成界面膜。石菖蒲油主要成分为α-、β-、γ-细辛醚，分子式为C12H16O3，符合微乳油相要求，且预实验过程中发现，单独选择石菖蒲挥发油作为微乳油相可以形成均一透明的微乳液，且单独选择模型药物作为微乳油相有利于提高药物浓度，提高载药量，因而选择模型药石菖蒲挥发油作为微乳的油相。 2.3.2 助表面活性剂（COS）的选择 采用指标成分溶解量法，测定石菖蒲挥发油中指标成分β-细辛醚分别在乙醇、PEG200、PEG400、丙二醇、丙三醇、异丙醇等常用药物辅料COS中的溶解度。分别量取过量的各COS 5 mL，分别加入装有2 mL上述各COS的试管中，振荡摇匀，超声溶解30 min，使COS充分溶解目标成分，3 000 r/min离心5 min，吸取COS层溶液经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液稀释适当倍数，参照“2.2.9”项方法测定各样品溶液中β-细辛醚的含量，结果石菖蒲挥发油在乙醇、PEG200、PEG400、丙二醇、丙三醇、异丙醇中的溶解度（以β-细辛醚计）分别为13.61、8.23、5.62、11.87、16.82、9.41 mg/mL。可知β-细辛醚在丙三醇中的溶解度最大，为保证微乳的载药量，选取对指标成分β-细辛醚溶解量大的丙三醇为微乳的COS。 2.3.3 表面活性剂（S）的选择 减小S用量，有利于提高制剂的安全性及药物浓度，因而通过考察形成微乳所用最少表面活性剂用量（MSmin）筛选微乳S，考虑到O/W型微乳的S亲水/亲油平衡（HBL）值要求，适宜的HBL值为8～18，故初步选取聚山梨酯80、60及泊洛沙姆407、CEL、RH40为考察对象。将油相-石菖蒲挥发油与丙三醇（COS）-按质量比1∶2混合均匀，往该体系中逐滴加入上述各S，混匀，取1滴滴入10 mL水中，观察油/水混合状况，并测定粒径，记录微乳形成时的MSmin，并计算此时S在混合体系中所占质量分数，结果形成石菖蒲挥发油微乳的聚山梨酯80、60及泊洛沙姆407、CEL、RH40的MSmin在系统中所占质量分数分别为72.35%、67.52%、47.56%、33.28%、39.84%。可知以MSmin为评价指标，CEL所加入比例最小，预示在S中，其加入量最少即可形成微乳，乳化能力最强，因此确定微乳S为CEL。 2.3.4 电导率-含水量法绘制伪三元相图 已确定微乳的组分：油相为石菖蒲挥发油，S为CEL，COS为丙三醇，采用电导率-含水量法绘制伪三元相图相图，确定微乳区域。首先配制不同Km值（S/COS的质量比）的混合表面活性剂（Smix），Km值分别为1∶2、1∶1、2∶1、3∶1。而后将油相与Smix分别按0.5∶9.5、1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1的质量比例混合，室温下往混合相中逐滴加水，漩涡混匀，绘制电导率-含水量曲线，同时采用目测法记录体系由澄清变为浑浊或由浑浊变为澄清的临界点各相比例，用Origin Pro 8.5软件绘制伪三元相图，结果见图1。可知Km值由0.5增大到2.0微乳区域（图片涂黑区）逐渐增大，而Km值由2.0增大到3.0微乳区域反而减小，微乳形成的澄清点呈上移趋势。故确定微乳处方的Km值为2.0。 2.3.5 最优微乳处方的确定 根据微乳稳定性要求，一般选取伪三元相图微乳区的中央附近点作为微乳处方。从形成微乳区域最大的Km＝2的伪三元相图中央区选取5个点作为微乳处方，每个处方平行配制3份微乳，分别对其电导率、黏度、稳定性、粒径分布进行评价比较，结果见表1。由结果可知，新制备的各处方微乳电导率、黏度相近，无显著差异。与处方5相比，处方1、3、4有极显著差异 （P＜0.01）；放置3个月后，处方1、3、4微乳粒径变化小，说明其稳定性较好；处方2微乳粒径变化大，相比前几个处方，说明其稳定性较弱。而处方5出现了浑浊，说明微乳结构膜已破坏。综合考虑药剂安全减少辅料用量，及药物载药量考虑，最终确定最优微乳处方为处方3，即石菖蒲挥发油6.25%，CEL 20.83%，丙三醇10.42%，水62.5%。 2.3.6 石菖蒲挥发油微乳鼻喷剂制备工艺验证 称取CEL 20.84 g，丙三醇10.41 g，将两者充分混合均匀，而后往混合项中逐滴加入6.25 g石菖蒲挥发油，边加边搅拌，待充分混匀后，再往混合项中逐滴滴加蒸馏水62.5 g，边加边搅拌，直至搅拌形成透明均一的微乳系统，经0.22 μm滤膜滤过，分装至5 mL聚乙烯塑料瓶中，即得石菖蒲挥发油微乳鼻喷剂。平行重复3批。均制得澄清、均一、透明橙黄色微乳，表面有乳光，与筛选的最优微乳处方一致，可重复性良好。 2.4 石菖蒲挥发油微乳鼻喷剂性质考察 2.4.1 石菖蒲挥发油微乳鼻喷剂的相关理化性质 根据最优处方制备的石菖蒲挥发油鼻喷微乳为均一0.21）mPa∙s（n＝3）；pH值为6.31±0.01（n＝3），电导率为（115.60±0.41）μS/cm（n＝3）。 2.4.2 粒径及分布 取3批自制的石菖蒲挥发油鼻喷微乳，稀释约10倍后测定其粒径。结果（图2）显示，3批样品的平均粒径为（30.5±0.2）nm，呈正态分布，多分散系数（PDI）为0.150±0.002。 2.4.3 形态观察 采用电子显微镜，对石菖蒲挥发油微乳鼻喷剂的粒径进行考察。将石菖蒲挥发油鼻喷微乳进行适当稀释，对稀释样品进行染色制片。将载有支持膜的铜网置于蜡板上，在膜上滴加复方湿疹微乳凝胶稀释液一滴，自然晾干20 min。再滴加2%磷钨酸1滴，自然晾干10 min，用滤纸吸走多余的液体，置于透射电子显微镜下观察，照相，见图3。由透射电镜照片显示，微乳乳滴为圆球形，外观圆整，大小均在100 nm内。 2.4.4 透皮性能考察 配制相同药物浓度（石菖蒲挥发油质量分数6.25%）的石菖蒲挥发油微乳与普通乳（石菖蒲挥发油-OP10乳化剂-水6.25∶31.25∶62.5）进行体外透皮性能考察。取石菖蒲挥发油微乳和普通乳液各5 mL，分别加入Franz扩散池，渗透膜为小鼠腹部脱毛全皮，所用鼠皮的厚度均一，有效扩散面积为4.50cm2，接收池体积为18 mL，接收介质为生理盐水，于32 ℃、200 r/min实验，以石菖蒲挥发油中的β-细辛醚为考察指标，分别于1、2、4、6、8、10、12 h抽取5 mL接收液（同时补加5 mL空白接收液），过0.45 μm微孔，参照“2.2”项下方法，测定接收液中β-细辛醚含量，以上实验，石菖蒲挥发油微乳和普通乳分别平行做5组，取均值，绘制渗透曲线，拟合参数，得药物体外经皮渗透动力学曲线方程见表2，通过比较体外经皮渗透动力学参数稳态透皮速率（Js）和单位面积累积渗透量（Qn），可以看出石菖蒲挥发油微乳较石菖蒲挥发油普通乳液透皮速率提升了14倍，透皮性能得到显著提升。 Qn＝Cn/A Js＝dQ/dt Cn＝Cni＋V0/VCps Q为药物的累积渗透量，Cn为t时间药物的校正质量浓度，Cni为t时间药物的实测质量浓度，Cps为t时前药物的实测质量浓度，V0为每次取样体积，V为接收液的总体积，Qn为t时间单位面积累积渗透量，A有效扩散面积 2.4.5 石菖蒲挥发油微乳对蟾蜍鼻黏膜纤毛的影响 采用在体法考察鼻黏膜纤毛毒性[20]。选取18只蟾蜍，随机分成3组（每组6只），其中以生理盐水喷鼻的为阴性对照组，以1%去氧胆酸钠溶液喷鼻的为阳性对照组，以石菖蒲挥发油微乳鼻喷剂喷鼻的为微乳组。将蟾蜍仰卧固定，分别往上颚黏膜滴加生理盐水、1%去氧胆酸钠溶液、石菖蒲挥发油微乳0.5 mL，使完全浸没上颚。30min后用生理盐水清洗药物，分离出大小约为5 mm×5 mm的蟾蜍上颚黏膜，用生理盐水洗净，将黏膜朝上平铺于载玻片上，用生理盐水润湿，盖上盖玻片，光学显微镜下（10×40倍）观察纤毛运动情况。再将载玻片室温放置于加有少量生理盐水的密闭容器内，每隔20 min取出，显微镜下观察，并记录各组内每片蟾蜍黏膜纤毛持续运动时间，计算平均值，计算纤毛持续运动时间的百分比，即给药组平均纤毛运动时间与阴性对照组的纤毛运动时间之比，结果见表3。一般以纤毛持续运动时间百分比大于85%为制剂的安全阈值[21]，本实验中阳性对照组纤毛持续运动时间百分比为5.50%，有明显的纤毛毒性；与阴性对照组相比，石菖蒲挥发油微乳组平均纤毛持续运动时间无显著性差异，纤毛运动时间百分比为93.58%，表明石菖蒲挥发油微乳对鼻黏膜纤毛运动基本无影响，没有显著毒性，具有较好的鼻腔给药安全性。 3 讨论 微乳一般选用较短链（C8～C18）的油作为油相，因为短链油容易嵌入S与COS形成的界面膜中[22]。石菖蒲挥发油主要成分为α-、β-、γ-细辛醚，分子式为C12H16O3，符合微乳油相的要求。且预试验中，单独选择石菖蒲挥发油作为微乳油相也可以成功形成微乳，可以减少辅料用量，提高载药量，因而选作微乳油相，并对微乳处方做进一步优化考察。 为保证药物的载药量，在选择微乳S与COS的筛选辅料时，都首先考虑了微乳辅料对药物的表观溶解度，选择对石菖蒲挥发油（以β-细辛醚为考察指标）溶解性好的辅料。再结合伪三元相图的绘制，通过比较形成微乳区域的大小，确立Smix比例，在考察S与COS的比例（Km值）过程中发现：Km值由0.5增大到2.0微乳区域逐渐增大，这主要是因为S的比例增大，S在油/水界面膜具有柔嫩性，减少微乳形成界面膜张力，乳化能力增强，形成更大的微乳区域。而Km值由2.0增大到3.0微乳区域反而减小，这可能是由于S增加到一定值后，体系黏稠度增加，凝胶区、双连续型区域扩大，缩小了微乳（O/W）形成的区域。且随着Km的增大，微乳形成的澄清点呈上移趋势。 在伪三元相图中，位于微乳区中央的微乳处方，受微乳各相变化幅度更宽，因而具有更好地稳定性，通过选取位于微乳区域中央的5个微乳处方，通过比较形成微乳的电导率、黏度、粒径、稳定性发现：微乳油相比例的升高，微乳稳定性下降；在微乳区域里，相图条件下，S的比例越高，其微乳的稳定性越好，综合考虑微乳稳定性与载药量筛选出最优微乳处方。 本实验制得最优石菖蒲挥发油鼻喷微乳，均一、透明、澄清有光泽，平均粒径为（30.5±0.2）nm，稳定性好，与同等药物浓度的石菖蒲挥发油普通乳相比，体外透皮性能提高了14倍，且采用经鼻给药（透过黏膜），避免了石菖蒲现有口服给药存在肠道毒副作用、肝脏首过效应，吸收利低，为临床治疗老年痴呆提供一种新的高效、低毒、安全方便的中药制剂石菖蒲挥发油鼻喷微乳奠定基础。 参考文献（略） 来 源：李绍林，段 启，赵珍东，夏 黎，刘卫海，汪小根，沈小钟. 石菖蒲挥发油微乳鼻喷剂的制备及其质量评价 [J]. 中草药, 2019, 50(8):1935-1941.
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