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位点特异性重组也称保守性重组，常发生在原核生物。位点特异性重组发生在特殊的DNA序列对之间，依赖小范围同源序列的联会，同时重组也只限于发生在这一小范围。 1.λ噬菌体DNA整合 1）整合位点的结构 整合通过λDNA和细菌DNA之间的位点专一性重组实现，这些特定位点叫做附着位点。细菌DNA上的附着位点称为attB,大约长25bp，位点bio和gal基因之间，分为B、O、B’3个序列组分。λ噬菌体的附着位点称为attP.由P、O和P’三个序列组成，场240bp。attB和attP中两侧的B、B’和P和P’，P'称为臂，其序列结构各不相同，但两者的O序列完全一致，由15bp组成，λDNA的整合和切利都发生在该序列，因此，O序列也成为核心序列。 2）λDNA的整合 λ噬菌体的DNA双联线状结构，进入大肠杆菌细胞后通过首尾连接形成环状DNA。在λ噬菌体基因int的产物的结合酶（Int）和一个整合宿主因子IHF蛋白作用下，λDNA上的POP'序列与大肠杆菌染色体上的BOB’序列实行同源联会，然后通过双方DNA分子的断裂重接，λ噬菌体的DNA整合到大肠杆菌DNA分子中。整合到大肠杆菌DNA分子中的λ噬菌体成为原噬菌体，在λ原噬菌体DNA分子两边个形成一个att位点，其中一个位点是attL，序列组成是POB',两个位点都是重组的产物。 在整合过程中，首先两个环状DNA分子变成一个大环，然后attB和attP的核心序列（O序列）中的链断裂与重接，在attP和attB位点上产生同样的交错接口，形成5’—OH和3'-P的末端，交错切口的5’单链区为7bp,且attB和attP两个核心区的断裂完全相同。对特异性DNA具有强烈的亲和力的Int与attP，attB位点结合后，利用其拓扑异构酶活性使DNA两个双链各自断开一条单链瞬间旋转后交换连接，形成Holliday中间体。另外两条单链通过相同的过程断裂重接，完成双链间的重组。因此，当整合反应发生时，即在attP和attB处发生交叉重组，产生两个较小的环状DNA。在整合过程中，4条链同时被切断，交叉，然后磷酸二酯键又重新连接，期间没有发现任何稳定的中间产物。 3）整合的酶学机制 Int是一种DNA结合蛋白，对POP’序列有强的亲和力，只能催化BOB’和POP’之间的重组，不能催化BOP’与POB’之间的重组，所以，只有Int存在时，整合反应不可逆。整合酶实际上起拓扑异构酶的作用，使带有att位点的超螺旋松弛，也可产生交错的断裂，即有7个核苷酸的单链尾端，形成黏性末端。 整合宿主因子IHF蛋白含两个不同的亚单位，该两个亚单位分别被宿主的himA，himD基因编码。整合酶Int和IHF在att上有特定的结合位点，每次重组过程需要20-40个整合酶分子及约70个IHF蛋白分子。Int和IHF以协同的方式与att位点相结合，Int的结合位点有4个，每个结合位点长约30bp，而IHF的结合位点有3个，与Int和IHF与attP结合时，形成一个复合物，又称“整合体”，在整合体中所有的结合位点都集中在蛋白寡聚体的表面，此整合体的形成需要attP超螺旋。 2.λ噬菌体DNA切离 如果λ原噬菌体受到诱导，整合作用将被逆转，此过程称为切离。切离后，细菌和噬菌体DNA恢复至原来状态，λ噬菌体和细菌的att位点分别恢复为attP(POP')和attB(BOB')。除了Int和IHF外，催化切离反应时，还需一种由λ噬菌体xis基因编码的切离酶Xis参加。 位点特异性重组：①位点特异性重组属于保守性重组，这种交换式可逆或向后的，原先存在的DNA序列全部被保存下来，没有丢失；②噬菌体和细菌的DNA之间有一段很短的同源序列，重组交换发生于该同源序列的一个特异性核苷酸。 |
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