【新知解读】如何从FFPE中获取高质量的DNA？

图片来源：参考文献[1]

肿瘤组织样本是反映疾病真实状况的最佳样本，但不易获得。据悉，世界上保存着数十亿的组织样本，其中绝大多数是石蜡包埋样本。随着新技术的发展，肿瘤组织的研究从病理层面深入到分子层面，对样本质量的要求更高。

福尔马林固定石蜡包埋样本（Formalin-Fixed Paraffin-Embedded, FFPE）是二代测序（Next Generation Sequencing, NGS）肿瘤检测最常用的样本之一，因其特殊的前处理方法，在提取及整个实验过程中均有其相应的秘籍。

我们之前已有介绍关于减少FFPE DNA损伤的推文“想要制备高质量的FFPE DNA？DNA损伤了解一下”。结合燃石试剂盒，本文介绍了如何从FFPE样品中提取优质DNA。

一、FFPE样本的特点

FFPE样本，即用福尔马林固定、石蜡包埋的组织样本。因其能更好地维持组织细胞的结构，便于临床研究及更好地保存样本，该方法已经被普遍应用。组织样本在前处理中的不规范操作，可能会导致不同程度的DNA损伤^[2]，影响NGS检测。

二、提取FFPE样本的秘诀

1

从源头抓起，完善样本的前处理

离体时间：取材后应在30min内及时固定，防止组织变质^[3]。

样本要求：选择合适大小的组织块制作石蜡包埋组织样本，一般不超过15x10x5mm^[4]。

固定液选择：建议使用10%中性福尔马林固定液对组织进行固定^[5,6]，固定液应为被固定标本体积的5-10倍^[7,8]，并定期更换。

固定时间：根据样本情况调节固定时间，一般在24-48h为宜^[4]，固定时间过长会加重FFPE DNA的片段化。

包埋要求：选用纯净且熔点适宜的蜡，包埋要迅速，禁用明火^[7]。

切片厚度：包埋好的组织样本根据需要确定切片厚度，标准切片厚度为4um，用于核酸提取的切片可以在10-20um，保证切片厚度的持续稳定^[4]。

2

选择合适的提取试剂盒

目前市场上有多种提取试剂盒，选择合适的试剂盒才能保证实验的成功率。以下是燃石医学自主研发用于组织的核酸提取或纯化试剂盒，提取产物的结果较优。试剂盒组分存放温度有三种（图1）：

图1.燃石的核酸提取或纯化试剂盒

粤穗械备20170022号

3

提取高质量的DNA

脱蜡

使用环保型脱蜡剂通过一步法进行脱蜡，替代了传统的二甲苯脱蜡法。如脱蜡不彻底，可加倍脱蜡剂。

裂解消化

样本+ATL+蛋白酶K共同作用，消化2h或过夜，保证消化完全。蛋白酶K可以消化蛋白质组分以及样品中可能存在的任何核酸酶。

解交联

90℃孵育1h，能有效达到逆转交联的目的。若解交联温度过高或时间过长，会加重DNA片段化程度^[9] 。

若解交联后不立即处理，应分离出裂解液待温度恢复室温再放4℃。这是目前唯一的安全停止点。

除RNA

在解交联后加入RNA酶，除去反应液中的RNA，保证得到的是纯DNA。

核酸Binding及洗涤

磁珠和裂解液充分混匀，待吸附反应达到平衡再弃液。洗涤要充分，目的是洗去残留的盐分和试剂，保证产物纯度。

磁珠晾干

磁珠晾干到无反光即可。过分干燥会导致磁珠很难洗脱下来，损失DNA；晾干不够，洗脱产物会残留有洗涤液，影响后续建库的酶反应。

洗脱

提前把洗脱液预热，易于把磁珠上的DNA洗脱下来，提高洗脱效率。

把控每一步实验，提取过程应注意如下事项（表1）：

表1.核酸提取注意事项

三、常见问题分析及解决方法

从前处理、提取、建库到测序分析，FFPE样本常见问题复杂多样，其中绝大部分问题和样本直接相关，可以通过回溯实验过程及分析来优化实验（图2）。

图2.常见问题分析及优化

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    参考文献：

[1]http://www./sub/showarticle.asp?ewsid=92377&sub_id=1025.

[2]夏颖哲.福尔马林对固定标本DNA提取和扩增的影响[J].四川动物,2006,25(3):662-665.

[3]中国临床肿瘤学会肿瘤标志物专家委员会,中国肿瘤驱动基因分析联盟.二代测序技术在肿瘤精准医学诊断中的应用专家共识[J].中华医学杂志,2018,98(26):2057-2065.

[4]生物样本库指导性文件技术规范与控制程序,版本号V1.00.样本前处理规范（人）[DB/OL].国家基因库.

[5]Bancroft J D.Theory and practice of histological techniques[M].London:Churchill livingstone,2008:53-74.

[6]Canson F L. Histotechnology. A self-instructional text[M].Chica-go: American Society of Clinical Pathologists Press,2009:4-44.

[7]中华医学会编著.临床技术操作规范病理学分册[M].北京：人民军医出版社,2004.

[8]梁晓俐.病理学基础与实验技术[M].北京:军事医学科学出版社,2004.

[9]https://www./us/resources/resourcedetail?id=7d3df4c2-b522-4f6d-b990-0ac3a71799b6&lang=en.

关于燃石医学 

燃石医学（纳斯达克代码：BNR）成立于2014年，公司使命为“用科学守护生命之光”，专注于为肿瘤精准医疗提供具有临床价值的二代基因测序（NGS）。公司业务及研发方向主要覆盖：1）基于NGS的肿瘤患病人群检测，6年间，燃石累计检测样本超过18.5万例，在中国拥有最高的市场份额；2）基于NGS的癌症早检，目前已经进入临床验证阶段。燃石医学于2018年7月获国家药品监督管理局（NMPA）颁发的中国肿瘤NGS检测试剂盒第一证，在体外诊断领域具有里程碑式意义。实验室获得广东省临检中心颁发的“高通量测序实验室”技术审核，以及得美国CLIA和CAP实验室质量体系资质认证。公司将继续致力于开发创新可靠的NGS检测产品，推动肿瘤精准医疗领域的发展。