【新知解读】靶向测序之“弱水三千，只取一瓢”

刘得光3p6n6zqq 2021-12-28

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如果你需要大海里特定品种的鱼，你会选择用渔网直接捕捞，

还是选择投放特制鱼饵，吸引目标鱼上钩？

相信睿智的你，肯定会选择后者！

靶向测序的核心，即靶向富集目标序列。

下面小燃带你去看看如何在大海中靶向捕“鱼”。

靶向测序方法介绍

目标区域测序，又称靶向测序，是指目标序列富集后测序的研究策略。它可根据不同的应用，利用较低的数据量得到理想的灵敏度和准确度。相较全基因组与全外显子测序，靶向测序能够聚焦目标区域，去除冗余数据干扰，测序成本低且测序深度深，能高效经济发挥NGS技术的优势，并广泛应用到临床检测、疾病筛查等众多领域。

现在常用的靶向测序方法主要有三类^[1]：

I. 杂交捕获法（Hybrid capture）

II. 分子倒置探针富集法（Molecular inversion probes，MIP)

III. PCR富集法

我们从原理入手，先来认识下这三种靶向测序方法。

杂交捕获法

杂交捕获法包括固相和液相杂交捕获法两类。固相杂交捕获法是先选定目标DNA区域，在芯片上修饰与目标区域互补的探针；随后在芯片上进行DNA与探针的杂交反应；最后将与探针杂交的DNA洗脱下来用于后续的测序工作（图1左）。目前市面上的代表产品是Roche NimbleGen，特点是使用超高密度、叠瓦式排布的DNA探针，具有高富集均一度等。

液相杂交捕获法是目前被广泛应用的靶向测序方法，根据碱基互补原理定制带有生物素的探针，在液相中与目的序列杂交，通过链酶亲和素修饰的磁珠吸附带有生物素的探针，富集目的DNA片段（图1右）。

图1.杂交捕获方法（固相+液相）^[1]

分子倒置探针富集法

分子倒置探针富集法即通过设计口袋型的探针，此探针两端(红色序列Target complementary region）能与目的区域退火，然后利用DNA聚合酶及连接酶补平缺口成完整的环状探针，通过外切酶将游离的探针消化。完整的探针与目标区段的序列，利用通用序列作为后续文库构建的引物[黑色序列，即PCR Primer, Probe-release clevage site；绿色序列用于Hybridization based detection；蓝色序列Tag-release clevage site]，后续添加带有生物素标记的核苷酸（黄色序列）与其过夜杂交，产物可直接作为二代测序文库。但此法由于捕获均一性差探针成本高，目前鲜有使用。

图2.分子倒置探针富集法^[1]

PCR富集法

多重扩增PCR，又称扩增子建库技术。

该技术首先利用多重引物PCR反应，同时扩增多个目标区域序列，得到的扩增子产物通过PCR或酶连接反应，将二代测序接头序列（adapter）引入，得到扩增子文库，进行靶向测序^[2]。

图3. 基于PCR的富集法^[8]

靶向测序策略选择

从富集基因数及样本数比较不同方法学的适用性及可行性，代入样本量及单个样本所需检测基因数可获得合适的检测方法，但选择合适的测序方法还需考虑更多因素（图4）。

图4.靶向富集方法的适用性^[1]

表1则分别从成本，适用性、样本量、灵敏度、特异性、一致性及重复性各方面作比较。

表1.靶向测序方法介绍^[1]

靶向测序策略各方法学性能对比简单归纳如下：

PCR富集法：灵敏度高，检测速度快；但其检测区域小，一般适用于少量基因或者热点突变的检测；另外同时使用多对引物可能产生非特异性扩增和二聚体，且扩增的GC偏好导致覆盖均一度差（影响CNV），是PCR富集法相比杂交捕获法的一大劣势。

MIP富集法：无需剪切基因组DNA即可捕获目的序列，探针含测序引物等，因此样本质量要求低且建库时长短。但面对目的长序列及高GC含量区，MIP探针设计困难且均一度差，捕获效率低，目前鲜有使用。

杂交捕获法：探针设计为重中之重，捕获效率均一性表现优异。杂交捕获方法能够在单个实验中比PCR更快，更方便地捕获大目标区域。

其中固相杂交相比多重PCR，其对大区域的富集有明显优势，且固相杂交代表产品NimbleGen SeqCap的超高密度叠瓦式探针排布策略灵敏度高，所需的测序深度更低，但需要微阵列玻片及昂贵的硬件。液相杂交无需专门设备即可进行溶液内靶标富集，比固相杂交更易于扩展，灵敏度和特异性也表现优异。

下面重点介绍应用最为广泛的液相杂交捕获法，各性能主要取决于探针种类、设计等，具体区别如下：

■ 核酸探针比较

核酸探针类型分为RNA和DNA^[3]两类，DNA探针又分为ssDNA和dsDNA^[4]，具体特点^[^5][6][7]如下：

表2. 核酸探针类型比较

此外，基于不同类型探针的特异性限定（即杂交的错配容忍度）及合成成本等因素，汇总目前市面上不同品牌探针分类如下^{[4][5][8][9][10]}：

表3.不同品牌探针分类及长度对比

■ 探针覆盖策略比较

比较固相杂交（NimbleGen SeqCap）、液相杂交（Agilent SureSelect）、MIP （Agilent Haloplex）和PCR（illumina Nextera）的覆盖策略（图5）各方法的不同参数结果。

图5.不同方法对目标区域的覆盖策略^[11]

可见MIP选择覆盖目标区域两侧，其他探针都是直接覆盖目标区域。SeqCap探针密度更高、叠瓦式设计，Agilent采用RNA探针等策略^[13]。不同探针长度、设计方式及探针之间的覆盖程度策略，直接影响文库复杂度，均一性等测序结果。

■ 探针设计参数

密度与交错程度Density:

End to end是常规探针设计方式，密度表示目标区域中每个核苷酸所需探针数。

Overlap tilling是设计叠瓦式探针。

重复序列的捕获程度Masking：

高拷贝重复区，设计时降低探针密度，减少非特异序列的结合。

高GC区探针弥补Boosting：

高通量测序过程当中，高GC区段被测到的概率会比较低。因此需要针对高GC区域多设计探针弥补GC Bias^[14]。

此外，不同杂交捕获探针设计时参考数据库以及可捕获范围也会有所区别^[15]。

小结

所谓合适的才是最好的，实验室选择靶向测序方法及产品时应充分考虑^[12]：

I. 实验室条件及设计方案的比较：

如商品化试剂盒是否满足需求，起始样本在质量和数量上有无要求，成本等；

II. 性能因素：

实验的简便性及可扩展性，时间成本，是否能自动化和所需要专用硬件的要求等；

III.富集和测序效果的比较：

突变类型，中靶率，覆盖均一性及灵敏度等。

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参考资料：

[1]Mamanova, L., Coffey, A., Scott, C. et al. Target-enrichment strategies for next-generation sequencing. Nat Methods 7, 111–118 (2010).

[2]https://www./techniques/sequencing.html

[3]Gnirke, A., Melnikov, A., Maguire, J. et al. Solution hybrid selection with ultra-long oligonucleotides for massively parallel targeted sequencing. Nat Biotechnol 27, 182–189 (2009).

[4]https://www.

[5]https://www.

[6]Marcy, Joshua. 'RNA Methods: A Lab Guide.(RNA Methodologies: A Laboratory Guide for Isolation and Characterization)(Brief Article)(Book Review).' Genomics & Proteomics June(2005).

[7]Janine, Meienberg , et al. New insights into the performance of human whole-exome capture platforms. Nuclc Acids Research 43.11(2015):e76-e76.

[8]https://www.

[9]https://www.

[10]https://sg./pages

[11]Samorodnitsky, Eric, Datta, Jharna, Jewell, Benjamin M. et al. Comparison of Custom Capture for Targeted Next-Generation DNA Sequencing.Journal of Molecular Diagnostics Jmd (2015).

[12]Kozarewa, Iwanka , et al. Overview of Target Enrichment Strategies.Current Protocols in Molecular Biology 112(2015):7.21.1.

[13]https://earray.chem./suredesign/help/Create_a_SureSelect_design_with_the_wizard.htm

[14]https://www./zh-cn/video/custom-sureselect-design

[15]Clark, M., Chen, R., Lam, H. et al. Performance comparison of exome DNA sequencing technologies. Nat Biotechnol 29, 908–914 (2011).

关于燃石医学

燃石医学（纳斯达克代码：BNR）成立于2014年，公司使命为“用科学守护生命之光”，专注于为肿瘤精准医疗提供具有临床价值的二代基因测序（NGS）。公司业务及研发方向主要覆盖：1）基于NGS的肿瘤患病人群检测，6年间，燃石累计检测样本超过18.5万例，在中国拥有最高的市场份额；2）基于NGS的癌症早检，目前已经进入临床验证阶段。燃石医学于2018年7月获国家药品监督管理局（NMPA）颁发的中国肿瘤NGS检测试剂盒第一证，在体外诊断领域具有里程碑式意义。实验室获得广东省临检中心颁发的“高通量测序实验室”技术审核，以及得美国CLIA和CAP实验室质量体系资质认证。公司将继续致力于开发创新可靠的NGS检测产品，推动肿瘤精准医疗领域的发展。