想要制备高质量的FFPE DNA？DNA损伤了解一下

福尔马林固定石蜡包埋样本（FFPE）因其易于长期保存，所以在临床病理检验、肿瘤基因检测和医学科学研究过程中多采用此种方法保存患者的组织样本。在利用二代测序技术进行精准治疗时，很大程度上依靠这些组织样本。

然而，由于肿瘤的异质性和正常细胞的干扰，肿瘤体细胞突变往往难以被发现。虽然二代测序技术可以进行深度测序，找到低频突变，但有证据表明，在FFPE DNA样本中检测到的一些序列突变可能是样本处理过程中遭受损伤所致^[1]。

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DNA损伤

为了减少序列假象（sequence artifacts）对肿瘤突变检测结果的影响，首先我们来了解一下DNA损伤有哪些类型。

     

图1 FFPE DNA中存在的DNA损伤^[2]

（来源：Do, H. et al. | Clinical Chemistry ）

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交联

即大分子（如蛋白质和核酸）两两之间发生交联。甲醛导致DNA损伤的原因主要源自其羰基亲电性和较小的空间位阻，使其易于与核酸和蛋白质发生交联。在体外，甲醛先与蛋白质或核酸上自由的氨基反应生成不稳定的羟甲基加合物，然后再进一步与其他核酸或蛋白质反应形成稳定的交联物^[3]。

在上述甲醛导致的各种交联类型中，主要形成DNA和组蛋白的交联。这一过程是甲醛先快速的和组蛋白反应，然后再和DNA外环的氨基结合形成DPC（即DNA-蛋白质交联）。

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碱基转换

在FFPE DNA样本中存在C>U或C>T。在体内，胞嘧啶自发水解脱氨变成尿嘧啶，发生频率约为每个细胞每天190次，可通过碱基切除修复恢复成胞嘧啶，而在体外则无法修复。此外，CpG二核苷酸中的胞嘧啶水解脱氨，转化成胸腺嘧啶，产生T:G错配。

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碱基脱落

DNA分子丢失了嘌呤碱或嘧啶碱后形成的脱碱基位点。当组织在福尔马林中固定时，福尔马林中的甲醛在空气中容易被氧化成甲酸，甲酸降低了福尔马林的pH值。而嘌呤碱基与糖骨架的N-糖苷键易于在低pH下发生水解，致使DNA碱基脱落。此外，脱碱基位点可以通过β-消除反应进行自发切割，导致DNA链断裂。

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DNA片段化

FFPE DNA的片段化程度会随着保存时间的延长和固定中使用的福尔马林pH值的降低而增加。与来自新鲜FFPE DNA相比，保存时间长的FFPE DNA进行PCR，成功率较低。说明样品在保存期间，DNA片段化这一现象可能一直在发生。

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“解救”DNA

那么，想要获得高质量的FFPE DNA，我们可以从以下方面“解救”DNA。

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样本固定及保存

1.1 中性福尔马林固定液

正如前文中提到的，甲醛pH降低容易导致碱基脱落，甚至是DNA断裂。有研究表明，将乳腺癌组织样本同时用中性缓冲福尔马林固定液和非缓冲福尔马林固定液处理，发现用中性福尔马林固定液处理过的样本DNA片段化较少^[4]。同时，中性缓冲福尔马林固定液也可降低DNA交联的发生。基于此，我们推荐使用10%中性福尔马林固定液对组织样本进行固定。

       

图2 不同福尔马林缓冲液制备乳腺癌FFPE 

DNA的QC比率对比

（来源：Nagahashi, M. et al. | Journal of Surgical Research）

注：QC比率表示DNA质量的相对量度。

高QC比率表示DNA片段化较少，反之亦然。

1.2 样本厚度、固定体积和固定时间

组织固定，组织块不宜过大。凡是需要固定的组织，都不应该太大太厚，这是因为所有的固定液穿透力不够强、浸透度不够快的缘故。如果较大较厚的组织，不经处理就进行固定，那么待固定液进入至中间，可能这些组织早就发生自溶了。一般所取组织块厚度建议不超过5mm。

固定液量的足够与否决定着组织固定的成败，推荐固定液体积应为被固定标本体积的5～10倍。根据标本的大小选择合适的体积。若标本过大，可取些脱脂棉或纱布，浸湿固定液后，盖于组织表面，以免组织被风干，影响制片效果。

组织样本固定的时间通常不超过48小时，根据组织样本的体积控制固定时间。通常活检标本为 6～24 h；手术切除标本为 12～48 h^[5]。极小的标本，如穿刺样本建议固定时间在4～6 h。对于后续要进行二代测序的标本，固定时间不足，组织自溶，核酸酶释放，核酸随之降解；若固定时间太久，核酸与核酸、核酸与蛋白产生过多的交联，在后续解交联步骤后核酸产生较多损伤，通过PCR扩增，易产生假阳性突变。

1.3 包埋温度

石蜡作为组织包埋剂，其温度设置对DNA质量有不同程度的影响。一般尽量选择低熔点蜡，且熔蜡的温度设置为比熔点高2℃，可使固体石蜡全部液化即可。包埋用熔蜡的温度应<65℃，温度太高，DNA发生部分解链，组织内残留的痕量甲醛可对解链后的DNA单链进行甲基化修饰，修饰后的DNA单链在冷却后不易复性而导致降解。

1.4 保存温度

合适的蜡块或切片存储条件，将会减缓DNA降解的速度。常规的FFPE样本一般保存在室温下。有资料显示，当FFPE样本储存在4℃时，DNA降解程度较低^[6]。

图3 不同储存温度下蜡块DNA完整性的比较

（来源：Daniel, G. et al. | Plos One ）

注：组织样本来源于大鼠。

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样本提取

2.1 脱蜡

由于石蜡可阻碍消化液对组织的渗透，从而抑制蛋白酶K与组织内蛋白的接触，影响组织消化和DNA释放。所以在DNA提取过程中，脱蜡一定要彻底。

目前，二甲苯和环保脱蜡液都可用于FFPE样本的脱蜡。用不同脱蜡液提取石蜡组织标本DNA，发现两者并无明显差异^[7]。二甲苯是一种有毒的有机试剂，在实验过程中如果身体接触到会有一定程度的危害，且二甲苯脱蜡过程繁琐，实验过程涉及到的试剂种类较多，容易出错，故推荐一步法脱蜡。一步法脱蜡采用环保脱蜡液，使用安全，且脱蜡和裂解消化同步加热进行，在省去中间离心去上清步骤的同时，又可避免蜡残余导致消化不完全。

               

图4 不同脱蜡液提取FFPE DNA的纯度、浓度检测结果

（来源：何燕 et al. | 临床与实验病理学杂志）

2.2 消化时间、温度

在消化过程中，消化时间与温度也会影响DNA提取质量。温度过高不利于保护DNA，过低则不利于蛋白酶K消化。一般认为蛋白酶K的最适工作温度为56℃，而37℃则是大多数酶的最适反应温度。将37℃和56℃两个温度下蛋白酶K消化FFPE组织进行比较，发现56℃消化获得的DNA量较多，且质量较高^[8]。而消化时间从2小时到7天^[9]不等，一般认为适当延长消化时间有利于DNA的提取。具体消化时间可根据实验需求调整，以组织消化彻底，组织消化液清亮为准，但是要保证在消化时间延长过程中稳定酶浓度，每延长24h补加一次蛋白酶K，确保消化彻底。

2.3 其他因素

样本提取过程中，为了提高DNA的洗脱效果，可将DNA洗脱液提前放置37℃预热5min。

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结语

综上，我们知道，对于FFPE DNA样本来说，无论是交联、碱基转换、碱基脱落抑或是DNA片段化，都是不可避免会发生的现象。为了减少DNA损伤影响，需要采取相应的措施来降低假突变风险。

就组织样本而言，取材结束后，就要对样本进行固定。固定一般采用10%中性福尔马林固定液，样本厚度建议不超过5mm，固定液与组织的比例至少应为5:1，固定时间通常不超过48小时。包埋时，尽量选择低熔点蜡，将包埋温度设置成比熔点高2℃。此外，制备好的蜡块或切片置于常温保存，若条件允许的话，置于4℃保存，效果更佳。

在FFPE DNA提取过程中，脱蜡是否彻底是提取高质量DNA的重要步骤。推荐使用一步法脱蜡。由于组织中DNA和蛋白质相结合，若想释放充分的DNA，则需56℃消化2h或过夜消化。同时，通过提前37℃预热洗脱液5min，也可提高DNA得率。

参考资料：

1. Chen, L. , Liu, P. , Evans, T. C. , & Ettwiller, L. M. . (2017). dna damage is a pervasive cause of sequencing errors, directly confounding variant identification. Science, 355(6326), 752-756.

2. Do, H. , & Dobrovic, A. . (2015). Sequence artifacts in dna from formalin-fixed tissues: causes and strategies for minimization. Clinical Chemistry, 61(1), 64-71.

3. 吴凯. (2006). 甲醛与细胞内DNA-蛋白质交联的关系. 国家环境与健康论坛.

4. Nagahashi, M. , Shimada, Y. , Ichikawa, H. , Nakagawa, S. , Sato, N. , & Kaneko, K. , et al. (2017). Formalin-fixed paraffin-embedded sample conditions for deep next generation sequencing. Journal of Surgical Research, 220(48), 125.

5. 石远凯, 孙燕, 于金明, 丁翠敏, 王子平, & 王长利, et al. (0). 中国晚期原发性肺癌诊治专家共识(2016年版). 中国肺癌杂志.

6. Daniel, G. , Christian, V. , Daniela, P. , Nadine, D. , Kurt, Z. , & Real, F. X. . (2018). Impact of storage conditions on the quality of nucleic acids in paraffin embedded tissues. PLOS ONE, 13(9).

7. 何燕, 王建东, 时姗姗, 章如松, 周晓军, & 马恒辉. (2013). 环保脱蜡液与二甲苯对石蜡包埋组织dna质量影响的比较. 临床与实验病理学杂志, 29(2), 226-227.

8. 田子强, 刘俊峰, 张少为, 李保庆, 王福顺, & 张月峰. (2004). 普通甲醛固定石蜡包埋组织dna提取方法的探讨. 癌症, 23(3).

9. Warford, A. , Pringle, J. H. , Hay, J. , Henderson, S. D. , & Lauder, I. . (1988). Southern blot analysis of dna extracted from formol–saline fixed and paraffin wax embedded tissue. Journal of Pathology, 154(4), 313.

以上，就是本期想与大家分享的“获取高质量DNA”的小技能，你get到了吗？