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NSCLC患者接受靶向治疗前进行相关靶基因检测已成为各国指南共识，所以基因检测结果的准确性很重要。在实际检验中，临床标本的采集、处理和保存等对检测的结果往往有决定性的影响，因此，为保证得到高质量的检验结果，必须有一个规范的操作程序。 一、患者的选择，什么样的患者需要做基因检测？ 1、晚期NSCLC：包括腺癌、大细胞癌、组织分型不明确的患者及混合组织学类型的鳞癌患者。 2、需术后辅助治疗的Ⅱ期及Ⅲ期NSCLC患者。ADJUVANT及EVAN研究结果显示对于EGFR敏感突变的II~IIIA期给予TKI药物治疗的DFS相比于化疗的DFS均有延长，且安全系数更高。具体数据可参考《早期NSCLC患者术后辅助治疗-靶向治疗》。 注：此时建议对患者的详细信息，如病理诊断、分期、疾病治疗史做记录，以便后续数据分析。 二、标本的选择，哪些标本类型可用于基因检测？ 1、FFPE标本：最常用的标本类型 1.1 病理质控：在FFPE样本进行核酸提取前，要进行HE染色，确定肿瘤类型及肿瘤细胞比例，肿瘤细胞数量至少要200个。 1.2 切片：手术组织样本5μm切5-10张，穿刺活检组织5μm切10-20张，根据病理质控结果，达到所需的200个肿瘤细胞以上，必要时建议对肿瘤细胞进行富集。在切片时有2种方式，一种是切白片放在组织玻片上，一种是切蜡卷放入干净的1.5ml EP管中。 1.3 核酸提取：选择CFDA认证的核酸提取试剂盒进行核酸提取。 注：1 建议使用3年之内的FFPE标本进行检测，避免核酸严重降解影响检测结果； 2 切片时应注意避免产生交叉污染，每切一个样本需将刀片擦拭干净，清扫切片机时注意避免碎屑飞入装蜡卷的空EP管中。 3 使用二甲苯去除石蜡时，可在56℃加热5min，以便更好的溶解石蜡，避免后续有石蜡残留抑制PCR反应。 2、新鲜组织：可获得高质量的核酸 2.1 标本处理：因为新鲜组织样本中Dnase和Rnase都是活的，会降解核酸，所以核酸提取前样品的保护处理非常重要。新鲜组织切除后（组织量不低于0.2g），需立即放入4-8倍体积的组织保护液中。-70℃以下条件贮存，时间不得长于3年。若无-70℃以下条件，则在-20℃以下条件中贮存，时间不得长于1个月。组织已经置于液氮或-70℃以下环境中保存的，分离前加入10倍体积的组织保护液，置于4℃中解冻。 2.2 标本运输：将新鲜组织放置于组织保护液中，于冰盒中低温运输。 2.3 核酸提取：选择CFDA认证的核酸提取试剂盒进行核酸提取。 3、胸水样本：适用于有胸腔积液的患者 3.1 标本处理：胸水样本采集后要尽快离心（3000rpm离心10min）取沉淀后低温保存，建议将胸水标本制备成细胞蜡块，这样既可以进行病理质控，也便于长期保存。 3.2 病理质控：将包埋所得蜡块切片进行HE染色，确定肿瘤类型及肿瘤细胞比例，确定是否适用于基因突变检测。 3.3 核酸提取：选择CFDA认证的核酸提取试剂盒进行核酸提取。 3、血液样本：取材便捷 血液检测具有无创、匀质，易采集的优点，特别是针对服用TKI药物进展的患者，临床上再次活检比较困难，使血液检测成为临床检测EGFR突变的新选择。 3.1 患者选择：由于血液中含有肿瘤细胞较少，因此进行血液检测应选择IIIB或IV期晚期NSCLC病人，初治病人以检测敏感突变为目的，EGFR-TKI治疗病人以检测T790M为目的，须知化疗和TKI治疗会降低检测阳性率。 3.2 血液采集：采用EDTA抗凝管获得10ml全血，不得使用肝素抗凝管（由于肝素使得DNA抽提得率降低并在DNA提取过程中难以去除，肝素也会导致PCR效率降低）。血液采集后立即轻柔颠倒10次，颠倒不充分或颠倒不及时可能发生凝血均导致提取结果欠佳。 3.3 血浆分离：得到的全血应尽快离心分离血浆，建议不超过2小时（禁止冷冻血液标本，建议4℃保存）。两次充分离心（2000g10min, 8000g 10min）后小心吸取转移血浆： 3.4 血浆质量评价 3.4.1 血浆溶血：如发生严重溶血，标本不可用，血红蛋白及其代谢产物可能抑制Taq酶活性，使PCR扩增效率明显降低。下图中1/2/3号样本可以检测，4号中度溶血，5号严重溶血，均需重新采血进行检测。 3.4.2 血脂过高：使血浆呈乳白色，低密度脂蛋白对荧光有屏蔽和吸收作用，故对PCR有干扰，可建议患者空腹采血。 3.5 血液运输：如需长途运输，建议采用专用常温采血管（可在常温放置7天不影响检测结果）。 3.6 cfDNA提取：选择CFDA认证的核酸提取试剂盒进行核酸提取。 三、基因检测方法的选择，什么样的技术最合适？ 进行基因检测选择哪一种检测技术，有一个判定标准，首先：技术灵敏度和特异性：敏感性是指灵敏度，就是指其能测出多少突变丰度。特异性通俗的讲就是准确性，就是结果对不对，测的是不是这个东西。再者：是否得到CFDA认证：基因检测技术必须先形成技术标准、经过严谨的临床验证确定产品质量稳定，检测数据可靠、专家评审通过后才能通过CFDA上市，只有通过CFDA认证的产品才真正算得上是靠谱的。具体参考之前推文《SuperARMS，一种经得起临床验证评估的高灵敏度血液检测技术》。 另外附上目前常用检测技术的对比表。 如果从临床应用来说，由于有法规约束，因此目前ARMs是唯一可以应用于临床上面的技术，并且既可以用于组织检测也可以用于血液检测；ddPCR和SuperARMs（ARMs升级版，针对血液研制，灵敏度0.2%）敏感度较高，主要针对血液检测；而NGS技术对于未知突变和耐药途径的发现是很好的一个手段。实际应用中可根据不同的需求，选择不同的技术即可。 四、肺癌相关基因及检测意义 |
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