Science Immunology | TRAF6抑制MALT1酶活阻止了致命炎症

当抗原被淋巴细胞表面的抗原识别受体（TCR/BCR）识别后，就会激活适应性免疫。当TCR被激活后，会招募并形成由CARD11/BCL10/MALT1（CBM）组成的复合体。CBM复合体作为桥梁，将TCR信号传递给下游的IKK/NF-kB和c-Jun的N端激酶通路。其中MALT1是一种paracaspase蛋白，但是在CBM复合物中，主要行使的是骨架功能，通过招募TRAF6，激活下游的NF-kB信号通路。MALT1的蛋白酶活性同样行使着非常重要的功能，剪切的底物非常多，例如：在细胞信号传递相关的A20、BCL10、CYLD和HOIL-1；转录调控相关的RelB；RNA代谢相关的Roquin-1/2、Regnase-1和N4BP1。当MALT1酶活被抑制时，T_reg细胞的发育和功能会被严重破坏，导致T细胞过度活化，最终引发自身免疫炎症。

TRAF6对TCR下游NF-kB的激活是必不可少的，但是也有研究发现TRAF6缺失小鼠的效应T细胞不受正常T_reg的调控，过度活化，表明TRAF6在T细胞中还有着抑制T细胞活化的功能。因为TRAF6对NF-kB的激活功能是依赖于MALT1，那么TRAF6-MALT1的相互作用是否也在抑制T细胞活化中发挥着重要功能呢？

2021年11月12日，德国亥姆霍兹慕尼黑环境与健康研究中心（Helmholtz Zentrum München–German Research Center for Environmental Health）的Daniel Krappmann团队在Science Immunology上发表题为TRAF6 prevents fatal inflammation by homeostatic suppression of MALT1 protease的文章。重点介绍了在静息状态下，TRAF6与MALT1结合能抑制MALT1酶活性，从而阻止MALT1对Roquin-1/2和Regnase-1等抑制基因表达的蛋白分子剪切，进而避免致命的自身免疫炎症。由于已知在TCR激活的条件下，TRAF6和MALT1的结合对于NF-kB的活化至关重要，因此TRAF6像一个“开关”一样控制着T细胞的稳态。

MALT1与TRAF6的相互作用，抑制致命炎症的发生

研究者利用CRISPR-Cas9技术构建的MALT1^TBM/TBM（与TRAF6相互作用的序列发生错义突变）小鼠在3 - 4周龄时停止生长，呈现驼背姿势，且必须在出生后3-6周龄（平均年龄27天）进行人工喂养。此外，研究者还发现相对于MALT1^TBM/+小鼠来说，MALT1^TBM/TBM小鼠肺、肝、肠、肾都发生严重的炎症细胞浸润。在18天时，MALT1^TBM/TBM小鼠还未在体重上表现出明显差异，但是其脾和淋巴结发生了明显的肿大，血清中的炎症因子也是明显增加。分析脾脏和淋巴结中的T细胞、B细胞发现，B细胞表达高水平的CD69和CD86，T细胞表达高水平的CD69，进一步分析还发现CD44^hiCD62L^loCD4⁺和CD8⁺效应/记忆T（TEM）细胞的大量积累，伴随着CD44^loCD62L^hi CD4⁺和CD8⁺ T (T_naive) 细胞的大量减少，标志着淋巴细胞的过度活化，并且伴随着致命炎症。

已知抑制MALT1的酶活性会导致T_reg的发育和功能受阻，失去对活化T细胞的抑制，从而引起T细胞过度活化，但是在MALT1^TBM/TBM小鼠中，T_reg细胞和CD4⁺效应细胞的数量和功能几乎不受影响，甚至更强。因此MALT1^TBM/TBM导致的过度活化与T细胞本身相关。

于是作者在T细胞特异性敲除MALT1的基础上，继续在T细胞中特异性表达MALT^TBM/TBM（Malt1 TBM-T），并且同时构建了T细胞特异性敲除TRAF6的小鼠（Traf6-rT），以及T_reg中特异性表达MALT1^TBM/TBM的小鼠（Malt1 TBM-Treg），发现在生理表现上，当Malt1 TBM-T小鼠和Traf6-rT小鼠成长到12周后，会出现皮肤湿疹和表皮炎症，表现出T细胞驱动的免疫紊乱，并且也伴随着脾脏肿大，而Malt1 TBM-Treg小鼠无明显表现。在T、B细胞的表现上，Malt1 TBM-T小鼠和Traf6-rT小鼠与MALT1^TBM/TBM小鼠基本一致，而Malt1 TBM-Treg小鼠与MALT1^TBM/+小鼠基本一致。这些结果进一步说明了过度活化是由T细胞本身引起的。

已知在TCR激活的条件下，MALT1-TRAF6的结合对T细胞的活化来说至关重要，但是在Malt1 TBM-T小鼠和Traf6-rT小鼠中，TCR的激活信号却不能传递到NF-kB，导致NF-kB不会入核调节相关基因的表达。但是在此过程中，作者无意中发现，在TCR未激活的静息状态下，Malt1 TBM-T小鼠和Traf6-rT小鼠的MALT1表现出蛋白酶活性，并对其底物Regnase-1和Roquin-1/2等进行剪切，而WT小鼠的MALT1并不表现出酶活性。由于Regnase-1和Roquin-1/2被剪切，导致IkBNS和ICOS的抑制被解除，其表达上升，促进T细胞的活化。

TRAF6抑制静息T细胞中的MALT1的蛋白酶活性

为了研究静息条件下MALT1表现出的酶活性，作者在MALT1 KO Jurkat T 细胞中过表达MALT1-TBM蛋白或者MALT1来作为研究的体系。首先作者验证过表达MALT1-TBM蛋白并不能在TCR激活的条件下活化NF-kB信号，并且发现MALT1-TBM与诱导激活的MALT1对底物CYLD的剪切都是发生在R324位点，并且它们的剪切速率没有区别，这说明TBM的突变并不会影响分子本身的酶活性，并且TRAF6 KO Jurkat T细胞与MALT1-TBM细胞表现出相同的表型。

接下来作者分别对MALT1和TRAF6进行各个重要位点的突变实验，发现MALT1的BCL10结合位点（MALT1B V81R）、二聚位点（MALT1B K513E）和单泛素化位点（MALT1B K633R）以及TRAF6的E3连接酶活性位点（TRAF6 C70A）和寡聚化位点（TRAF6 R88A/F118A）对于MALT1在静息条件下表现出来的酶活性都是必不可少的。

因为TRAF6-MALT1是TCR信号通路中的重要组分，于是作者通过在TRAF6-KO的基础上，进行BCL10、CARD11或者TCR受体a链敲除细胞系，发现TCR通路的缺失会完全抑制MALT1的酶活性，说明在TRAF6-KO细胞中表现出来的酶活性是依赖TCR信号传导的。由此得出，在静息条件下，TRAF6的E3连接酶活性能够抑制中低水平的细胞自主TCR信号所引发的MALT1蛋白酶活性。

失去与TRAF6的相互作用，MALT1的蛋白酶活性引起致命炎症

作者在MALT1^TBM/TBM的基础上，同时还引入了C472A突变，使得MALT1既不能与TRAF6相互作用，又失去了蛋白酶活性（Malt1^TBMPM/TBMPM小鼠）。Malt1^TBMPM/TBMPM小鼠与对照小鼠基本没有任何差异，体重和脾脏的重量几乎一样；各种淋巴细胞的比例也无明显改变，甚至淋巴细胞的激活标志CD69和CD86以及CD44^hiCD62L^loT_EM细胞也减少；同时血清中的各种炎症因子水平也保持在较低水平。由此得出，静息条件下，MALT1的酶活性是引起致命炎症的原因。

接下来，作者给TRAF6 KO Jurkat T细胞中，加入MALT1蛋白酶抑制剂MLT-943和MLT-985，发现MLT985能够更好的抑制MALT1的酶活性。于是，作者在Traf6-rT小鼠8周的时候，也就是开始出现T细胞过度活化的时候，给予MLT985腹腔注射，连续处理10天。通过分析分离出的脾脏CD4⁺ T细胞发现，MALT1的酶活性几乎被完全抑制，并且IkBNS和ICOS的表达上调也被抑制，淋巴细胞的活化也被抑制。同时伴随着已知的副作用，MALT1酶活性缺失导致的T_reg细胞发育和功能的严重破坏，但是自身免疫炎症却并没有发生。

在近期研究中，作者鉴定出人胚系MALT1突变（C.2418G> C），该突变导致了T6BM2基序中Glu（E）到Asp（D）的交换。这种突变会破坏TRAF6与MALT1之间的相互作用，并且阻碍NF-kB的激活，同时伴随着MALT1蛋白酶活性的激活。这样的突变与系统性红斑狼疮以及类风湿性关节炎有着较高的风险相关性，并且作者还初步提出利用MLT985来治疗相关疾病。

总而言之，作者通过这篇文章给我们揭示了TRAF6-MALT1相互作用对于免疫稳态的重要作用。

原文链接：

https://www./doi/10.1126/sciimmunol.abh2095