【原】细胞凋亡overview

一、

凋亡

为程序性细胞死亡 (Programmed Cell Death) 是机体主动的、高度有序地清除无用细胞的过程。

凋亡是个多事件的信号通路过程：

二、

细胞凋亡之PS外翻的检测

Annexin V是一种Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，对PS有高度的亲和性。可在Annexin V上偶联荧光素检测凋亡早期发生的PS外翻。由于死亡的细胞膜通透性增加，可用膜不通透性核酸染料结合DNA，区分死细胞。

 

 

流式实验结果图：

Annexin V实验注意事项：

1.保证细胞活性：避免用力吹打，避免胰酶消化时间过长，遇冷PBS清洗，缩短上机时间，可上机前5min再加核酸染料

2.EDTA尽量避免使用

3.结果分析需依据对照比较。

4.药物、病毒、质粒可能对细胞本底荧光都有影响。

5.左上象限一般是由于处理方式不当，或处理时间太久导致的非凋亡途径的细胞死亡，左上象限出现大量细胞，需要优化处理的浓度和时间梯度，以及优化细胞培养，细胞消化流程。

三、

细胞凋亡之线粒体膜电位

正常线粒体膜电位是维持线粒体进行氧化磷酸化、产生ATP的前提，是维持线粒体功能所必需，而凋亡过程中一个重要的变化即是线粒体膜电位的变化。

实验结果图：

实验注意事项：

1. 37℃ CO2培养箱中孵育。

2. JC-1现配现用。

3. pH的变化影响膜电位，保持平衡染液中pH的一致性。

4. JC-1会与蛋白结合，降低染料的浓度，引起假去极化。

5. 红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例。

四、

凋亡中晚期：Caspase-3的活化

细胞凋亡过程中，胞内主要蛋白通常被降解，调节这一过程的蛋白叫做Caspase（半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶）

实验结果图：

流式实验结果图	IHC免疫组化结果图	WB实验结果图

五、

细胞凋亡之DNA片段化

凋亡晚期DNA内切酶活性被激活升高，双链DNA在核小体之间切断形成~185bp为基数的有序片段。Tunel流式法:通过在核酸片段末端标记优势计算凋亡百分比。

通过DNA末端转移酶将带标记的 dNTP （多为dUTP）接到DNA片段的3’-OH端，再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果。