Frdbio®呼吸道合胞病毒(RSV) F蛋白ELISA检测试剂盒

试剂盒介绍：

呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus, RSV）属于副黏病毒科的肺病毒属（Pneumovirus），主要引起6个月以下婴儿患细支气管炎和肺炎等下呼吸道感染，以及较大儿童和成人的鼻炎、感冒等上呼吸道感染。其发生机制除病毒感染直接作用外，可能与婴幼儿呼吸道组织学特性、免疫功能发育未完善及免疫病理损伤有关。严重RSV疾病免疫病理损伤主要是机体产生特异性IgE抗体与RSV相互作用引起Ⅰ型超敏反应。

本试剂盒适用于体外定量检测人血清、血浆，细胞培养液或其它相关生物液体中呼吸道合胞病毒F蛋白含量。

试剂盒基本原理：

本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫定量法检测human RSV-F蛋白含量，酶标板采用纳米共价包被Human RSV F蛋白捕捉抗体，检测时酶标板孔加入待检样品或标准品，再加入F蛋白检测抗体（生物素化抗RSV F蛋白抗体）,反应后加入链霉亲和素HRP，最后加入单组份TMB底物液显色;如果待检样品中含有RSV-F蛋白，TMB底物液在HRP催化下显色，加入终止液终止显色后，在酶标仪OD450/OD630读取吸光值，在合适浓度范围内，吸光值大小与待检测样品中RSV-F蛋白浓度呈正相关，根据标准品浓度/吸光值绘制的标准曲线，可计算出待检样品中F蛋白含量。

实验所需自备物品:

1.酶标仪(带有450nm和630nm波长滤光片)

2.高精度移液器，EP管及一次性吸头：0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL

3.37℃恒温箱，双蒸水或去离子水

4.吸水纸

待检测样品的收集方法:  

1.血清：全血样品于室温放置2小时或4℃过夜后于1000×g离心20分钟，取上清即可检测，收集血液的试管应为一次性的无热原，无内毒素试管。

2.血浆：抗凝剂推荐使用EDTA-Na2，样品采集后30分钟内于1000×g离心15分钟，取上清即可检测。避免使用溶血，高血脂样品。

3.组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

4.细胞培养上清：取细胞培养上清于1000×g离心20分钟，除去杂质及细胞碎片。取上清检测。

5.其它生物样品：1000×g离心20分钟，取上清即可检测。

6.样品应清澈透明，悬浮物应离心去除。

7.样品收集后若在1周内进行检测的可保存于4℃，若不能及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃(1个月内检测)，或-80℃（6个月内检测），避免反复冻融。

8.如果您的样品中检测物浓度高于标准品最高值，请根据实际情况，做适当倍数稀释（建议先做预实验，以确定稀释倍数）。

检测前准备工作:

1.请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，将各组分平衡至室温。

2.洗涤液配制：将浓缩洗涤液用双蒸水稀释(1:25)。未用完的放回4℃。从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶，属于正常现象，可用40℃水浴微加热使结晶完全溶解后再配制洗涤液（加热温度不要超过50℃，使用时洗涤液应为室温），当日现配现用 。

3.标准品配制:瓶身标注有标准品含量 ：标准品为冻干品，使用前用PBS或者去离子水复溶到0.5ml（此时标准品浓度为C0）,然后根据需要,取适量标准品用通用稀释液 进行1：2倍比稀释（注：不要直接在反应孔中进行倍比稀释）。建议配制成以下浓度：C0、C0/2、C0/4、C0/8、C0/16、C0/32、C0/64，样品稀释液直接作为空白孔0。

例如：标准品管标注为25ng,加水0.5ml复溶，此时C0=50ng/ml, 用通用稀释液 进行1：2倍比稀释最为标准品的浓度依次为50ng/ml,25 ng/ml，12.5 ng/ml，6.25 ng/ml，3.13 ng/ml，1.56 ng/ml，0.78 ng/ml，0 ng/ml（稀释液作为空白对照）

4. 检测抗体工作液：实验前计算当次实验所需用量（以100μL/孔计），检测抗体（100×）用通用稀释液稀释100倍，实际配制时应多配制100-200μL；

5.链霉亲和素HRP工作液：实验前计算当次实验所需用量（以100μL/孔计），链霉亲和素HRP（100×）用通用稀释液稀释100倍 ，实际配制时应多配制100-200μL；

6.TMB底物液:使用前，提前放置室温平衡。