阅读 Nat. Commun.丨Type II TE domain催化氨酰基链的转移

氨酰或肽酰链的转移通常发生在上下游两个T domain之间，由C domain介导形成肽键。除此外还有一些其他的链转移机制，如在NRPS-PKS或NRPS-脂肪酸杂合途径中由KS domain介导链的转移；Type II TE将T domain上的中间体水解下来，为下游A domain提供特定的底物；AT domain介导T domain上的中间体转移到下游独立的T domain上以及T domain之间自发的链转移等。Legonmycins 5生物合成途径中含有两个NRPS蛋白，LgnB和LgnD，其domains的排列分别为A₁-T₀和C₁-T₁-C₂-A₂-T₂-TE，其中A₁和A₂ domain推测分别激活L-Thr和L-Pro(Figure 1)。另外，该途径中还含有一个Type II TE LgnA，推测负责异常中间体的解离。Legonmycin A(6)合成中形成了两个酰胺键，对应LgnD中两个C domain，但LgnB和LgnD中有三个T domains，T domains之间一个链的移位是否必须成为了一个有意思的问题。本研究通过一系列体外生化实验阐明LgnA、LgnB-T₀和LgnD-T₁ domains在链的转移中所扮演的角色，发现LgnA充当“适配器”的作用，介导两个独立蛋白LgnB-T₀和LgnD-T₁之间发生氨酰基的转移；同时发现在C₁ domain发生错误缩合时，LgnA可将异常中间体解离，确保合成的精准完成。

Figure 1. 不同的氨酰/肽酰链的转移方式

         首先，研究人员在大肠杆菌中获得了LgnB和LgnD的可溶性蛋白，以其活化形式进行体外酶反应时检测不到预期产物，但将LgnA蛋白加入以上反应体系，HPLC可检测到预期的产物6的生成，表明LgnA的存在对于6的生成很关键(Figure 2a)。采用化学衍生的方法(加入过量的巯基乙胺)将结合在NRPS domains上的中间体解离下来以便高分辨质谱检测，在6的合成中预期的中间体巯基乙胺加成物的形式包括Thr 7、IV-Thr 8、IV-Dhb 9、IV-Thr-Pro10和IV-Dhb-Pro11(IV=isovaleryl)(Figure 2b)。将活化的LgnB与L-Thr、ATP和巯基乙胺孵育，可检测到7的离子峰，证明LgnB-A₁确实激活L-Thr，随后将其转移到LgnB-T₀；将活化的LgnB、LgnD与底物及巯基乙胺孵育，可检测到7、8和10的离子峰，检测不到9和11；将LgnA加入上述反应，可检测到7-11，说明LgnA有助于Dhb的形成；当反应中去掉L-Pro时，仅产生7、8和9，8和9的存在暗示着脱水发生在NRPS-tethered IV-Thr中间体上，在与L-Pro缩合之前(Figure 2c)。为理解脱水在NRPS组装线上所发生的具体位置，将截断的蛋白LgnD-C₁-T₁、LgnA、LgnB及底物一起孵育时，可产生8；将截断的蛋白LgnD-C₁-T₁-C₂、LgnA、LgnB及底物一起孵育时，产生8和9，证实C₂ domain是脱水所必须的；而T₁ domain的点突变体LgnD-C₁-T₁(S492A)-C₂反应只产生8而非9，显示脱水反应发生在LgnD-T₁-tethered IV-Thr上，由LgnD-C₂所催化(Figure 2d)。

Figure 2. 途径重构及截断LgnD和LgnB功能分析实验中产物6和潜在的合成途径中间体7-11的HPLC和LC-MS分析

通过分析完整目标蛋白的MS可得知底物是否与蛋白共价结合。将LgnB-A₁-T₀、LgnD-C₁-T₁和L-Thr孵育时仅检测到LgnB-A₁-T₀-tethered L-Thr的存在；将LgnB-A₁-T₀、LgnD-C₁-T₁、L-Thr及LgnA孵育时可检测到LgnD-C₁-T₁-tethered L-Thr的存在，该结果表明LgnA催化L-Thr的氨酰基从LgnB-T₀到LgnD-T₁的转移；将LgnB-A₁-T₀、L-Thr、ATP及LgnA孵育时，几乎所有的LgnA被L-Thr氨酰化，证实LgnA不是将L-Thr水解下来而是充当氨酰转移酶的角色(Figure 3)。

Figure 3. LgnA催化Thr单元从LgnB-T₀到LgnD-T₁ domain的氨酰基转移

       将LgnB-A₁-T₀-tethered L-Thr、LgnD-C₁-T₁-tethered L-Thr、LgnA与IV-CoA孵育时，除了检测到预期的产物LgnD-C₁-T₁-tethered IV-Thr，还检测到LgnB-A₁-T₀-tethered IV-Thr，该产物推测是由C₁ domain在LgnB-A₁-T₀上非选择性缩合所产生。此外，holo-LgnB及IV-Thr-COOH 12在LgnA存在时可检测到，预示LgnA可能的水解酶功能。将LgnB-A₁-T₀-tethered IV-Thr与LgnA孵育时检测到holo-LgnB-A₁-T₀，而将LgnB-A₁-T₀-tethered IV-Thr与LgnA(S77A)孵育时LgnB-A₁-T₀-tethered IV-Thr保持完整，该结果表明LgnA可水解LgnB-A₁-T₀-tethered IV-Thr生成12(Figure 4)。

Figure 4. LgnA水解异常中间体LgnB-T₀-tethered IV-L-Thr

       综上所述，研究人员通过一系列的体外生化实验首次阐明独立存在的二型硫酯酶LgnA可催化两个NRPS的T domain之间发生氨酰基的转移；此外LgnA还可催化错误存在的中间体的解离。对该酶的进化树分析结果显示具有氨酰基转移酶活性的Type II TE可能并不少见(Figure 5)，本研究结果拓展了我们对于Type II TE功能的认识。

Figure 5. Legonindolizidine A生物合成中LgnA的双功能及LgnA的进化树分析

       本文共同通讯作者是英国阿伯丁大学的邓海教授、英国杜伦大学的StevenL. Cobb教授、武汉大学的虞沂教授以及英国华威大学的Matthew Jenner教授。邓海主要从事陆地及海洋来源微生物生物活性小分子发现、基于宏基因组挖掘和生物信息学分析的生物活性小分子的发现、抗生素和抗癌药物源分子生物合成途径和机理、新颖酶促反应机理研究及应用、建立新有机氟化物的分析测试方法、病院微生物生物活性小分子发现及这些小分子与鱼类免疫机制的相互作用研究；Steven L. Cobb的研究兴趣在于有机合成、肽及肽化学中新方法和技术的使用以解决具有挑战性的生物学难题；虞沂的研究兴趣在于通过代谢工程和组合生物合成研究植物和微生物来源的复杂天然产物的生物合成，并从中发现和发展具应用价值的药物；Matthew Jenner主要从事聚酮合酶和非核糖体肽合成酶的结构和生物物理性质表征等相关研究。

 

文章信息：Shan Wang, William D. G. Brittain, Qian Zhang, Zhou Lu, Ming Him Tong, Kewen Wu, Kwaku Kyeremeh, Matthew Jenner,* Yi Yu,* Steven L. Cobb,* and Hai Deng.* Aminoacyl chain translocation catalysed by a type II thioesterase domain in an unusual non-ribosomal peptide synthetase. Nature communications 2022,13, 62.

https:///10.1038/s41467-021-27512-0