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肿瘤浸润细胞（TIL）疗法是将切除肿瘤中的免疫细胞进行体外扩增培养，再注入患者体内进行治疗的一种过继细胞疗法。由于TIL先天的肿瘤特异性和抗原异质性，其对癌症细胞有优秀的杀伤能力，并且可以防止抗原丢失和脱靶效应[1]。因此，近年来TIL细胞疗法的发展如火如荼。 TIL细胞疗法已在黑色素瘤，非小细胞肺癌（NSCLC）的临床治疗上显示出良好的效果，然而，超过80%的病人在接受TIL细胞治疗后，都无法长期维持治疗效果。从目前针对TIL异质性的研究中可知，肿瘤中的大部分TIL细胞都处于耗尽（Exhausted）或旁观（Bystander）的状态[2]，无法对肿瘤细胞进行有效的免疫杀伤。这意味着大部分扩增的TIL细胞并没有治疗效果。 如何才能有效的分选和扩增TIL中真正具有抗肿瘤效果的TIL细胞亚群，从而改善细胞免疫疗法的治疗效果呢？ 近日，由加拿大两院院士，多伦多大学及西北大学讲席教授Shana Kelley教授领衔的研究团队，开发了一种将免疫磁珠和微流控芯片技术结合，用于筛选高效力TIL细胞的新方法，使得对稀有TIL细胞亚群的富集变得快速便捷。 这一重要研究成果今天发表在《自然》子刊Nature Biomedical Engineering上，中国留学生王宗杰为本文第一作者[3]。  论文首页截图 让我们先来了解一下目前TIL细胞富集中的挑战。 在肿瘤微环境中，TIL的含量是较为稀少的，以CD8 T细胞为例，其丰度常常低于1%。因此，从数以亿计的肿瘤细胞中富集稀有的TIL细胞是一项艰巨的任务。 现有的荧光分选和磁珠分选在通量和纯度上都不甚理想。目前临床上大多是将分选出来的少量TIL细胞进行多轮扩增培养，来获取足够数量的细胞用于后续治疗。冗长的细胞培养不仅增加了疗法的物料花费，也使得许多扩增后的TIL细胞处于耗尽状态，不利于后续治疗的开展。因此，临床上迫切需要一种新技术来提高TIL分选的速度和质量。 为了解决这个问题，Kelley团队设计了一套针对TIL细胞分选的微流控芯片，取名为MATIC（magnetic affinity targeting of infiltrating cells）。 MATIC脱胎于Kelley研究组于2016设计的“磁力细胞排序术”[4]。这项技术可以在全血中灵敏地捕捉被免疫磁珠标记的稀有循环肿瘤细胞，更可以基于细胞表面结合的免疫磁珠的数量，对被捕获的细胞进行排序和细分。通过对这些细分的肿瘤细胞亚群进行计数，可以准确的预测癌症患者体内癌细胞转移的程度。 针对TIL细胞的分选，Kelley团队重新设计了“磁力细胞排序术”。他们引入模块化的芯片设计，并大幅增加了芯片的面积，以满足TIL细胞分选中处理数以亿计的肿瘤细胞的需求。最终，新芯片MATIC诞生了。 MATIC的性能令人刮目相看。它每小时能够分选32亿个细胞。更厉害的是，在如此高的通量下，MATIC分选出的TIL细胞纯度高达95%和捕获效率达到了90%。 对于稀有TIL细胞的有效捕捉大大简化了后续扩增培养的过程，在Kelley团队所展示的B16小鼠黑色素瘤模型中，MATIC分选的TIL细胞只需要扩增5天就能达到用于治疗的细胞数量，远快于现有的磁珠（10天）和荧光分选（15天或更久）。此外，缩短的扩增时间也使得TIL细胞更具抗癌效果。在同样的细胞剂量下，MATIC分选的TIL细胞在注射回小鼠体内后有更好的肿瘤浸润，小鼠的中位生存期也更长。  不同细胞分选方法对TIL细胞扩增和治疗效果的影响 既然MATIC分选有如此高的通量，且分选的TIL细胞纯度超高，那么能否利用MATIC对CD8 TIL细胞进行进一步的分选，来除去处于耗尽和旁观状态，对治疗没有贡献的TIL细胞呢？ 答案是肯定的。 Kelley团队随后针对CD8 TIL细胞进行了基于CD39表达量的进一步的分选。不过，CD39是近期在细胞治疗领域争议较大的一个标志物，一些研究指出高表达CD39的TIL细胞有很强的抗肿瘤活性[5]和特异性[2]，而其他一些研究则表明低表达CD39的TIL细胞才是维持良好效果的关键[6]。 基于此，Kelley团队在分选时充分利用了MATIC分选对细胞进行细分的能力，根据CD39的表达程度，他们捕获了三个TIL亚群：CD39高，CD39中，CD39低。  从CD8 TIL细胞中可以根据CD39的表达分选出三个亚群 进一步分析显示，在MC38小鼠结肠癌模型中，CD39中等表达的亚群具有最佳的抗肿瘤效果。和其他亚群和未分选的TIL细胞相比，CD39中等表达的亚群可以将小鼠的中位生存期延长40%。  针对CD39中等表达的亚群进行分选能够显著提高TIL细胞疗法的效果 为了更加深入理解CD39中等表达亚群中T细胞的特点，研究团队对该亚群的标志物进行了深入的分析。他们发现CD39中等表达亚群中富含中央记忆型T细胞（TCM，CCR7+CD45RA-），并且大部分细胞均表达PD-1和TCF1。 此前，PD-1+TCF1+的T细胞亚群已被报道为具有干细胞特性的记忆型T细胞（TSCM）[7]。这类细胞具有诸多特点，包括对肿瘤的特异性和较强的自我更新能力。在小鼠模型中，这个细胞亚群对肿瘤生长有较好的抑制效果[7]。由于TCF1是一个细胞胞内标志物，在临床上较难基于其对细胞进行分选，因此，研究团队认为CD39这一细胞表面标志物，对干细胞样记忆型T细胞的临床分选，可能更具实用价值。  CD39中等表达的亚群中富含中央记忆型和干细胞样记忆型T细胞 研究团队随后从生物化学的角度，对CD39中等表达对T细胞在抗肿瘤效果中的作用做出了阐述。CD39是一种胞外核苷酸水解酶，它结合细胞外ATP（eATP）并将其转化为细胞外腺苷（adenosine）。由于腺苷具有极强的免疫抑制作用，CD39高表达的细胞亚群的免疫反应会被显著抑制。 此外，eATP在高浓度时具有毒性，CD39低表达的细胞亚群，由于无法将eATP转化为腺苷，会死于细胞毒性。基于此，Kelley团队相信CD39中等表达的细胞亚群，在富含eATP的肿瘤环境中更容易存活并进行免疫杀伤。 总而言之，这项研究表明对TIL中有抗肿瘤活性的亚群进行分选能有效的提高细胞免疫疗法的效果。 虽然学术界对于这类亚群的标志物的看法尚未统一[5-8]；但可以预见的是，MATIC这一超高通量的细胞分选方法，将对TIL亚群的筛选和标志物的鉴定起到极大的帮助。下一代肿瘤浸润细胞疗法的效果究竟几何，让我们拭目以待吧。 参考文献 [1] Rosenberg, S. Cell transfer immunotherapy for metastatic solid cancer—what clinicians need to know. Nat Rev Clin Oncol 8, 577–585 (2011). https:///10.1038/nrclinonc.2011.116 [2] Simoni, Y., Becht, E., Fehlings, M. et al. Bystander CD8+ T cells are abundant and phenotypically distinct in human tumour infiltrates. Nature 557, 575–579 (2018). https:///10.1038/s41586-018-0130-2 [3] Wang, Z., Ahmed, S., Labib, M. et al. Efficient recovery of potent tumor-infiltrating lymphocytes through quantitative immunomagnetic cell sorting. Nature Biomedical Engineering (2022). https:///10.1038/s41551-021-00820-y [4] Poudineh, M., Aldridge, P., Ahmed, S. et al. Tracking the dynamics of circulating tumour cell phenotypes using nanoparticle-mediated magnetic ranking. Nature Nanotech 12, 274–281 (2017). https:///10.1038/nnano.2016.239 [5] Duhen, T., Duhen, R., Montler, R. et al. Co-expression of CD39 and CD103 identifies tumor-reactive CD8 T cells in human solid tumors. Nat Commun 9, 2724 (2018). https:///10.1038/s41467-018-05072-0 [6] Krishna, S., Lowery, F., Copeland, A. et al. Stem-like CD8 T cells mediate response of adoptive cell immunotherapy against human cancer. Science 370, 1328 – 1334 (2020). https:///10.1126/science.abb9847 [7] S, Imran., Schaeuble, K., Chennupati, V. et al. Intratumoral Tcf1+PD-1+CD8+ T Cells with Stem-like Properties Promote Tumor Control in Response to Vaccination and Checkpoint Blockade Immunotherapy. Immunity 50, 195 – 211 (2019). https:///10.1016/j.immuni.2018.12.021 [8] Zheng, L., Qin, S., Si, W. et al. Pan-cancer single-cell landscape of tumor-infiltrating T cells. Science 374, 6574 (2021). https:///10.1126/science.abe6474 责任编辑丨BioTalker |
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