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来源：中华神经外科杂志, 2021,37(3) : 310-314. 脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤，其组织学特征包括坏死、周围脑组织浸润和微血管增生，其5年的总生存率<10%[1]。多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)是脑胶质瘤最常见的类型，其中位生存期为14.2个月，5年生存率<5%[1] 。在过去的几十年里，尽管在手术切除、辅助放化疗方面取得了一定进展，但胶质瘤的综合治疗仍然面临着巨大挑战[2,3]。由于胶质瘤的快速进展和复发，在肿瘤发生发展过程中进行早期筛查和实时监测对延长患者的总生存期起着关键作用。循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTC)检测作为液体活组织检查术的重要组成部分，具有方便、快捷和非倾入性等独特优势，在指导胶质瘤的综合治疗方面具有巨大的潜力。本文针对CTC在脑胶质瘤中的研究进展进行综述。 一、CTC和循环肿瘤微栓(circulating tumor microenmoli，CTM) CTC从肿瘤原发部位或转移性沉积物中脱落，然后进入外周循环，是肿瘤晚期发生转移的关键性因素[4] 。在预测预后、监测复发和精确治疗等领域，CTC作为一种通过微创就能获取的生物标志物，显示出了一定的潜力。尽管CTC的相关研究在进一步理解肿瘤浸润与转移的关系，以及肿瘤内部细胞的异质性方面做出了巨大贡献[5,6,7]；但由于缺乏脑胶质瘤发生颅外转移的相关证据，CTC在脑胶质瘤中的价值一直未得到重视。直到2014年，研究者才首次在GBM患者外周血中检测到CTC，证明了血行播散是GBM的固有特征[8,9,10]。Sullivan等[8]研究发现，进入外周循环的CTC以间质型(mesenchymal)为主，表现出较强的侵袭性，与GBM浸润区域的肿瘤细胞类型一致；同时，尽管GBM-CTCs与原发性GBM的EGFR基因型一致，但CTC的增殖能力明显低于原发性肿瘤。循环中的CTC处于一种类似'休眠'的状态，这可能有助于其逃避免疫监视。在随后的研究中，Gao等[11]在胶质瘤的各亚型中均检测到CTC，进一步证明了CTC的血行播散是胶质瘤的固有特征。同时，最新的研究观察到胶质瘤CTC的'归巢现象'：即循环中的肿瘤干细胞样CTC能够突破血脑屏障，定植在原发肿瘤部位，并形成一个恶性程度更高的、侵袭原发肿瘤的继发肿瘤[12]。这在一定程度上解释了胶质瘤在手术后容易复发并进展的原因。 随着对CTC的广泛关注，有研究观察到了一种现象：约5%的CTC由3～100个细胞的异质多细胞团组成，这些聚集的CTC被称为CTM[13,14]。研究表明，即使在外周血中只检测出1个CTM，患者的无进展生存期也会显著降低[15]。CTM中黏附能力增加的CTC细胞团可以吸引多种不同的非肿瘤细胞，包括白细胞、血小板、成纤维细胞、周细胞以及内皮细胞[16,17,18,19]，这些非肿瘤细胞在协助CTM进入循环系统、逃避免疫及远处转移的进程中起到重要作用。尽管CTC的存在被认为是'种子与土壤'理论的悖论[20]，但CTM在一定程度上让该理论有了更深远的意义：CTM(种子)携带适宜自己生长的土壤(非肿瘤细胞)形成一个稳定的生态位，不仅能够支持其在液体循环中生存，还能促进其在远处组织中的适应和增殖。尽管CTM已经在很多癌种中被捕捉到[15]，但其在胶质瘤中的研究进展却不尽如人意。Ge等[21]首次在1例右顶叶GBM患者的脑脊液中捕获到单个CTM，其由2个CTC和5个白细胞构成。随后Krol等[22]也报道了1例邻位复发的GBM患者外周血内存在大量由2～23个细胞构成的CTM。值得注意的是，除了上述2例患者，其余患者均未检测出CTM。所以，胶质瘤患者外周血中是否存在CTM，仍亟需进一步研究。 二、胶质瘤CTC富集及鉴定方法 目前，主流的CTC富集方法首先通过抗原抗体反应或物理方法进行CTC分离，随后利用免疫组织化学技术进行鉴定[23]。上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)是在上皮样肿瘤细胞表面表达的跨膜糖蛋白，被多种上皮样肿瘤检测平台用来进行CTC的分选[24,25,26]。对于胶质瘤等不表达EpCAM的癌种，以往的研究主要通过对白细胞进行'阴性富集'或利用CTC的物理性质进行分选[27]。 (一)物理性质分选 最早通过肿瘤细胞物理性质进行筛选的方法是梯度分离法(如ficoll-paque)，即根据浮力密度从血细胞中分离出CTC。还有通过上皮肿瘤细胞的大小分离的方法，利用8 mm孔径过滤器将上皮细胞源性CTC从血细胞中分离出来[28,29]。目前，应用于胶质瘤CTC检测及鉴定的方法主要有以下几种。 1．Ficoll密度梯度分离及神经胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)鉴定技术： Müller等[10]于2014年利用Ficoll密度梯度离心在GBM患者外周血中成功分离出CTC。Ficoll是一种蔗糖的多聚体，呈中性，密度较高时也显著低于正常生理性渗透压，同时不穿过生物膜，能够使细胞保持正常的生物活性。该研究将聚蔗糖-泛影葡胺作为分层液，加入外周血后离心，根据血中各种细胞的不同比重实现分离，CTC通常被分离至介质的上层。随后该研究利用神经GFAP作为鉴别CTC的标准，在141份血样中检测到29份(20.6%)存在GFAP表达阳性的细胞，即CTC。然而，近期有研究指出胶质瘤CTC不一定均表达GFAP，同时循环中还存在部分表达GFAP的非胶质细胞[11]。这解释了Müller等[10]的研究中CTC检出率较低的问题。 2．OncoQuick离心管及端粒酶启动子检测技术： Kojima等[30]于2009年提出了利用端粒酶检测肿瘤患者外周血中CTC的理论。端粒酶是一种在大多数癌细胞中表达的蛋白质，其通过维持染色体末端的端粒使细胞再生。由于端粒酶在正常细胞中很少表达，因此该研究设计了一种含有绿色荧光蛋白基因的腺病毒，其可以在表达端粒酶的细胞中选择性复制，使肿瘤细胞表达绿色荧光，随后研究者可以利用荧光显微镜区分血样中的CTC和非肿瘤细胞。 Macarthur等[9]于2014年首次应用端粒酶启动子检测技术检测胶质瘤患者外周血中的CTC。研究者首先通过OncoQuick离心管，由无菌的PP离心管、多孔栅栏及分层液组成，在高速离心的条件下实现CTC和血细胞的分离，随后将纯化的CTC利用含GFP基因的腺病毒在37开氏度的条件下转染24 h，最后通过荧光显微镜观察并筛选出CTC。在11例胶质瘤患者中有8例(73%)均检测到CTC，同时在每毫升外周血中平均可以检测出8.8个CTC，证明了这种方法具有较高灵敏度。同时，该研究还发现肿瘤细胞中Nestin的表达水平与端粒酶一致，因此，该研究进一步提出可以利用Nestin作为鉴别胶质瘤CTC的特异性标志物，但尚无后续研究证实其可行性。 3．Parsortix微流控设备及免疫荧光染色： 微流控设备主要是依靠CTC和白细胞的可塑变形性的巨大差异实现分选，变形性较强的白细胞可以快速通过设备中的孔道，而CTC常被截留。Krol等[22]利用Parsortix微流控设备，在不依靠抗原抗体反应的情况下实现CTC的富集。血液样本以与最窄通道段0.33 ml/s相对应的流速通过微流控设备，实现了CTC与血液成分的分离。研究者随后加入抗EGFR、Ki-67、微管结合蛋白EB1及CD45等抗体，并利用免疫荧光染色进行CTC鉴定。其中CTC的鉴定标准为：EGFR、Ki-67或EB1阳性，CD45阴性。在后续的试验中，该研究将在健康人群中检测出的假阳性背景(2个CTC/10 ml)设定为检出阈值，13例纳入研究的胶质瘤患者中有7例(53.8%)检出高于阈值的CTC水平。 (二)'阴性富集'技术 由于部分上皮源性CTC常发生上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal translation，EMT)，同时循环中还存在非上皮源性肿瘤细胞，传统的EpCAM无法作为此类CTC的特异性结合靶点。因此，研究者利用携带抗白细胞抗体的小磁珠与血中的白细胞特异性结合，实现白细胞的'负向富集'，通过消耗血中的白细胞实现CTC的分离[27]。 1．CTC-iChip技术及STEAM免疫荧光染色： CTC-iChip技术由Ozkumur等[31]于2013年首次提出，该装置首先利用携带CD45和CD16抗体的免疫磁珠特异性地与血液样本中的白细胞结合，实现其'负向富集'，随后将血液样本通过微流控设备，根据流体动力学去除血中的红细胞、血小板、血浆蛋白及游离磁珠，保留有核细胞，即CTC与少量剩余的白细胞。最后利用惯性聚焦对剩余的有核细胞进行横向和纵向排列，使其以最小的磁矩精确地偏转到收集通道中，最终实现CTC的富集。 在此基础上，Sullivan等[8]根据GBM细胞和白细胞的差异性表达基因研发出一种混合抗体STEAM(SOX2、Tubulin beta-3、EGFR、A2B5和c-MET)用于CTC的鉴定。后续的动物实验证明了CTC的鉴别标准为：STEAM阳性，DAPI阳性，CD45阴性。该研究利用CTC-iChip与STEAM染色检测胶质瘤患者外周血中的CTC，在33例GBM患者中检测出13例外周血中有显著高于阈值的CTC水平(39.4%)。然而，由于正常细胞也可能表达一个或多个标志物，使用混合抗体靶向多种蛋白质会导致'假阳性'的增加和背景水平的上升，这可能是导致健康对照组中CTC检出阈值较高的原因(CTC平均2.6个/ml，阈值为7个/ml)，从而导致CTC的整体检出率较低。此外，由于血中白细胞数量庞大，免疫磁珠的结合效率有限，因此血液样本中依然保留了一定数量的白细胞，这对后续CTC的鉴定造成了一定程度的干扰。 2．SE-iFISH技术： Ge等[21]于2015年提出了一种减数富集(subtraction enrichment，SE)的方法。该研究首先利用带CD45标记的免疫磁珠实现白细胞的'负向富集'，去除白细胞后再加入带有特殊涂层的免疫磁珠与CTC保持最小的非特异性黏附，实现外周血中CTC的快速富集。由于8号染色体的多倍体广泛存在于肿瘤细胞中，该研究开发出一种新型的CTC鉴别技术：利用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)技术检测细胞中的8号染色体，并将存在8号染色体的多倍体细胞作为CTC的鉴定标准[21]。 Gao等[11]于2016年应用SE-iFISH技术在31例胶质瘤患者中检测到24例含有CTC，这是目前已知的最高检出率(77%)。同时在健康对照者的外周血中均未检测出8号染色体的多倍体细胞，证明了这种方法具有高度的特异性。尽管如此，SE中使用的非特异性黏附的方法缺乏稳定性，免疫磁珠与CTC之间的黏附容易被破坏，导致了该方法的CTC检出数较低，平均每7.5 ml外周血中仅能检测出2.5个CTC(0.33个/ml)，显著低于以往的研究。此外，由于每毫升外周血中可检测到的CTC数量过少，不仅限制了对CTC理化性质、生物学行为的进一步研究，还限制了其临床应用。 (三)'阳性富集'技术 尽管'阳性富集'技术在神经上皮源性肿瘤中的应用备受限制，但研究者仍然开发出一种不依赖EpCAM进行'阳性富集'的CTC检测平台，并在胶质瘤中获得巨大成功[32,33]。Agerbæk等[32]研究发现，癌胚硫酸软骨素(oncofetal chondroitin sulfate，ofCS)在上皮源性肿瘤细胞和间质性肿瘤细胞中均能表达，同时还可以在发生EMT的肿瘤细胞中稳定表达，证实了ofCS是一种相较EpCAM更为广泛、稳定表达的'阳性富集'靶点。该研究同时指出重组疟原虫VAR2CSA蛋白(recombinant malaria VAR2CSA protein，rVAR2)能够与ofCS稳定结合，有望成为全新的CTC富集方式。Bang-Christensen等[33]在后续的研究中证实了rVAR2能够稳定地与多个胶质瘤细胞株相结合，其利用带有rVAR2涂层的小磁珠在多个胶质瘤患者外周血中成功捕获CTC(0.5～42个/3 ml)。尽管受限于研究规模，该研究尚未深入阐述CTC在胶质瘤中的意义和潜在应用，但其仍然为'阳性富集'技术提供了新的研究靶点、方向和思路。 三、胶质瘤CTM富集及鉴定方法 由于目前常见的捕获设备主要针对单个CTC，CTM的捕获仍然是一个挑战[34]。由于离心、高流速通常会破坏CTM的正常结构，部分研究认为低流速的微流控设备在捕捉CTM时具有独特的优势[35]。事实上，目前关于胶质瘤CTM的研究十分罕见。尽管如此，CTM作为一种高效的转移前体，可以携带大量非肿瘤细胞作为自己的'土壤'，支持其在远处组织中存活和生长。CTM的缺失是否是胶质瘤罕见颅外转移的原因，仍需进一步研究。 (一)SE-iFISH技术 Ge等[21]利用SE-iFISH技术在1例右顶叶GBM患者的脑脊液中成功捕获CTM，其由2个CTC和5个白细胞构成。该研究随后对患者进行MRI检查，未发现肿瘤转移。尽管如此，Gao等[11]在后续研究的31例患者中均未发现CTM，说明CTM可能并非胶质瘤的固有属性。此外，SE技术主要通过带有特殊涂层的免疫磁珠非特异性地黏附CTC，对于体积质量更大、细胞数更多的CTM，这种非特异性结合的稳定性较低，可能是导致其无法高效捕捉CTM的原因。 (二)Parsortix微流控设备及免疫荧光染色 Krol等[22]在2018年利用Parsortix设备首次在胶质瘤患者的外周血中分离出CTM。其研究纳入了13例胶质瘤患者，在1例远处复发的GBM患者的外周血中检测出了大量由2～23个细胞构成的CTM。该研究发现这些CTM共存在116个基因位点的突变，包含58个肿瘤相关基因，其中16个肿瘤相关基因的突变同时存在于原发肿瘤中。该研究证实了CTM来源于原发肿瘤，是明显的突变产物。该患者初次诊断时肿瘤位于右顶叶，而手术后肿瘤却在右颞叶复发，这种远处复发的现象可能与肿瘤侵袭性和转移性增强相关，但其与CTM之间的关系仍需进一步研究。 四、CTC检测在脑胶质瘤中的应用 (一)胶质瘤的辅助诊断 目前，病理学检查结果仍是胶质瘤诊断的金标准，患者需要进行开颅手术或立体定向手术获取部分肿瘤组织进行病理学检查以明确诊断。然而，位于功能区或脑干的肿瘤，将显著提高手术风险。此外，对于无法耐受手术的患者，病理学检查结果的缺失将会影响其接受辅助放化疗的效果，导致预后不良。尽管影像学的发展使胶质瘤的诊断方式更为全面、准确，但MRI上复杂多变的信号也使胶质瘤与其他肿瘤的鉴别充满挑战。因此，作为一种非侵入性、便捷的检测手段，CTC在肿瘤早期诊断中的应用有着巨大前景。尽管不同检测方法报道的检出数不同(0.3～14.0个/ml)，但可以确定的是，胶质瘤患者外周血中可以检测出明显高于正常对照组的CTC水平[8,9,10,11]，证实了CTC作为辅助诊断标志物的潜力。然而，在中枢神经系统恶性肿瘤中，胶质瘤仅占40%～50%，还有大量其他恶性肿瘤，包括生殖细胞瘤、中枢神经系统淋巴瘤、脑转移瘤等，因此实现肿瘤的鉴别诊断至关重要。在既往的研究中，对于CTC的鉴定方法包括端粒酶启动子检测、SE-iFISH检测、EGFR混合抗体免疫荧光染色及rVAR2检测等，均无法有效鉴别CTC的来源[9,11,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33]。至于特异性靶向GBM细胞的GFAP和STEAM染色又存在着蛋白水平表达不稳定、假阳性率高等局限性[8,10]。因此，仍然亟需更为敏感、特异的CTC鉴定方法，以进一步评估CTC辅助诊断的临床价值。 (二)辅助放化疗的疗效评价 术后辅助放化疗是胶质瘤综合治疗的重要部分，不同患者对于放化疗的敏感程度不同，目前只能通过O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O6-methylguanine-DNA methyltransfe-rase，MGMT)等分子诊断标志物来预测患者对放化疗的敏感程度，但对于疗效的实时评估仍然缺乏有效手段。基于此，CTC具有的实时监测、非侵入性等特点，有望实现患者外周血CTC水平的动态监测，以及动态地评估患者对于治疗的反应。在Macarthur等[9]的研究中，未接受放疗的11例胶质瘤患者中有8例均检测到CTC，而接受放疗的8例患者仅有1例检测出CTC。同时，Gao等[11]也指出接受放化疗的患者外周血中CTC显著低于放化疗之前。此外，还有研究指出GBM来源的CTC具有癌干细胞样(cancer stem cell，CSC)特征，能有效抵抗细胞毒性治疗(包括替莫唑胺化疗和放疗)和应激反应(包括细胞凋亡和自噬)[12]。单细胞RNA测序分析显示，胶质瘤CTC中Wnt通路被激活，诱导了CTC的干细胞化和放化疗抵抗。因此，作为一种高度耐药的分子，CTC的存在与患者放化疗的疗效联系密切。通过动态监测患者外周血中的CTC水平，能更好地预测和评价治疗效果。但受限于研究规模，仍亟需更全面的研究，以进一步评估利用CTC评估放化疗疗效的可能性。 (三)鉴别肿瘤复发与假性进展 目前，检测肿瘤复发的常规手段以MRI为主，但胶质瘤的假性进展与放射性脑损伤在影像学上与肿瘤复发相似，很容易混淆从而导致临床上的过度治疗[9,11]。有研究指出，肿瘤的假性进展通常与替莫唑胺化疗相关，在103例辅助化疗的高级别胶质瘤的患者中，有31.1%的肿瘤出现假性进展[36]。而放射性脑损伤通常出现在放疗3～12个月后，这将会进一步妨碍肿瘤复发的准确诊断[37]。由于CTC广泛存在于胶质瘤患者的外周血中，是肿瘤复发和转移的直接证据，因此在鉴别肿瘤复发与假性进展方面具有独特的优势。 Gao等[11]研究发现，在5例肿瘤全切除术后MRI上出现新的强化肿块的患者中，有2例患者未检测出CTC，随后MRI灌注成像(perfusion imaging，PWI)也证实强化部位为放射性坏死。而在2例检测出CTC的患者中，PWI同样提示肿瘤复发，后续的手术及病理学检查也证实了这一结论。值得注意的是，尽管剩余的1例患者检测出CTC，但PWI的结果却与其相左，否认了肿瘤复发。CTC检测结果与PWI的不一致使患者的病情评估更为困难，但随后的手术及病理学检查均证实了患者为肿瘤复发。事实上，接受辅助放疗的患者在疗程结束后的首次MRI中，超过一半以上的患者均出现假性进展[38,39]，对比PWI，CTC检测可能具有更高的准确性。因此，在鉴别肿瘤复发、放射性脑坏死及假性进展方面CTC有着独特的优势，可以成为活组织检查术和影像学检查之外的重要补充手段。 五、总结 在胶质瘤患者的外周血中检测出CTC是对肿瘤生物学认识的一个重大突破，其证实了外周循环是肿瘤进展、复发和转移的重要途径。目前的CTC检测技术大多针对上皮性肿瘤，导致胶质瘤CTC的检测面临着高耗费、低效率的困境，因此需要更为高效的检测技术和高特异性的鉴定手段。同时，目前的研究大多聚焦在CTC作为胶质瘤辅助诊断和预后预测的生物标志物的价值；然而，胶质瘤CTC表现的肿瘤干细胞样特性和放化疗抵抗，提示其不仅能成为一种生物标志物，还在成为胶质瘤治疗靶点方面具有巨大的潜力。因此，亟需更为深入、全面的研究以进一步评估其临床价值。 此外，目前的研究大多聚焦于单个CTC，而忽视了CTM。CTM作为'种子与土壤'理论的有力支持，是肿瘤细胞与免疫系统互相作用的直接体现：CTC能够与非肿瘤细胞(血小板、白细胞等)形成一个较稳定的'壁龛(niche)'，有助于CTM在远处组织中的适应和增殖。对CTM的研究可能有助于更深入地了解肿瘤与免疫细胞之间的关系，为新兴的免疫治疗开拓新的思路。 利益冲突 利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突 参考文献略
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