|
《Brain》杂志 2023 年6月8日在线发表意大利米兰IRCCS San Raffaele Scientific Institute的Giulia Berzero , Valentina Pieri , Pietro Mortini , 等撰写的综述《神经肿瘤学液体活检时代的到来。The coming of age of liquid biopsy in neuro-oncology》（doi: 10.1093/brain/awad195. ）。
液体活检在肿瘤学中的临床作用正在显著增长。在胶质瘤和其他脑肿瘤中，在不建议手术的情况下，对脑脊液(CSF)中游离DNA (cfDNA)进行靶向测序可能有助于鉴别诊断，并且与手术标本相比，对肿瘤异质性更具有代表性，从而揭示可作为靶点的遗传改变。鉴于腰椎穿刺获取CSF的侵袭性，因此对血浆中的cfDNA进行定量分析是患者随访的一个生动选择。混杂因素可能表现为伴随的病理(炎症性疾病、癫痫)或克隆性造血引起的cfDNA变异。先期研究提示，对血浆cfDNA进行甲基化组分析和通过超声临时开放血脑屏障有可能克服其中一些局限性。与此同时，对肿瘤调节cfDNA脱落机制的进一步理解可能有助于解密血液或CSF中cfDNA动力学的意义。 液体活检在神经肿瘤学中的挑战 20世纪70年代末，有证据表明癌症患者血浆中的循环游离DNA (cfDNA)水平高于健康受试者。后来的研究表明，部分cfDNA是肿瘤衍生的，可以用于癌症突变的无创检测，因此术语“液体活检”指的是使用肿瘤衍生核酸对肿瘤遗传谱的无创评估。在过去10年中，液体活检越来越多地用于疗效评估、早期检测治疗耐药、预后预测和治疗决策，在精准肿瘤学中补充甚至取代组织活检。商品化液体活检方法在临床应用中的验证证实了这一点。在结肠癌中，肿瘤cfdna指导的方法减少了辅助化疗的使用，而不影响无复发生存期。在一项纳入1,127例非小细胞肺癌患者的前瞻性研究中，肿瘤cfDNA的检测预测了较短的生存期，通过cfDNA测序确定的治疗靶点提供了生存优势，并且在1 / 4的病例中发现了cfDNA特异性突变，这代表了亚克隆耐药驱动因素。 由于仅部分被肿瘤破坏的解剖屏障(例如血脑屏障，BBB)，因此血浆液体活检给神经肿瘤学带来了更大的挑战(图1)。在胶质瘤患者中，不到10%有血浆来源的肿瘤来源cfDNA，而74-100%有csf来源的肿瘤来源cfDNA 。在肿瘤负荷高、肿瘤进展或肿瘤邻近脑室的患者中，cfDNA脱落至CSF尤其有意义。在靶向测序和突变检测方面，CSF-cfDNA比血浆- cfDNA提供的信息更多，在大多数胶质瘤或脑转移瘤患者中发现了至少一种肿瘤源性遗传改变。然而，腰椎穿刺是一种有创操作，不能在颅内压增高的情况下进行。脑室外引流可作为脑脊液的来源，当脑室造瘘术需要脑室肿瘤患者。然而，阻塞和感染的可能性可能增加模拟肿瘤进展的cfDNA量，因此阻碍了其作为CSF来源的应用。
图1神经肿瘤学中基于血浆和基于脑脊液的液体活检工作流程肿瘤来源的物质(cfDNA、EVs、CTC)。在CSF和血浆中释放。这两种液体的样本可在临床上通过腰椎穿刺或脑室分流术(CSF) 或静脉采血(血浆)获得。根据不同的方案，新鲜的生物流体应以不同的速度离心，这取决于它要寻找的材料，以便将上清液从颗粒中分离出来，并分离出感兴趣的材料。核酸可以从EVs或CTC中提取，然后通过荧光法或qPCR进行定量。一旦获得高质量的材料，就可以进行从全基因组测序到甲基组学的大量遗传分析。缩写:VS =脑室分流;cfDNA =游离DNA;EVs =细胞外囊泡;CTC=循环肿瘤细胞; WBCs =白细胞;NGS=二代测序;WES =全外显子组测序;WGS =全基因组测序 因此，在神经肿瘤学患者的纵向抽样中，血浆是cfDNA的一个较好的来源(图2)，使用高灵敏度PCR技术(如数字PCR)检测TERT突变(存在于60%以上的胶质瘤中，特异度为90%，敏感度为62.5%)对患者进行随访就是一个例子。血浆也是建立敏感的、基于免疫沉淀的方案的来源，该方案分析了少量循环cfDNA的甲基化组，从而能够检测富集于肿瘤特异性模式的大规模DNA甲基化变化。这一方法已成功扩展到脑部肿瘤，我们将在下文中讨论。 检测肿瘤游离细胞DNA 对cfDNA片段大小分布的观察发现了与核小体(~147碱基对)相关的DNA对应的峰，这表明cfDNA通过与核小体核心颗粒的结合而免受核酸酶的消化。由于这些关联组织特异性的，因此对血浆来源的cfDNA进行的全面分析允许进行预测核小体间距和转录因子足迹有助于追踪它们的组织来源，在健康个体中是淋巴样和髓样细胞。 与健康受试者相比，癌症患者血浆中的cfDNA水平较高，这是由于肿瘤细胞的高转换。在包括血浆和CSF在内的细胞外液中，坏死和凋亡细胞脱落DNA片段，这再次反映了起源细胞的遗传和表观遗传特征（Necrotic and apoptotic cells shed DNA fragments in extracellular fluids including plasma and CSF, again reflecting the genetic and epigenetic features of the cell of origin）。增加测序深度和使用校正算法可以部分补偿有限数量的肿瘤cfDNA。 儿科脑癌 在儿童患者随访方面儿科脑癌液体活检取得了长足进展。在髓母细胞瘤中，将CSF衍生cfDNA低覆盖度全基因组测序(WGS) 用于检测微小残留病(MRD)。在83%的肿瘤转移扩散病例中发现了基线时的肿瘤突变。在治疗期间，cfDNA的MRD持续存在与进展风险增加相关。在髓母细胞瘤和其他脑肿瘤患儿组成的队列中，通过靶向测序(MSK-IMPACT)发现CSF中有类似比例的cfDNA改变。然而，在另一个队列(包括258例不同诊断的患者(大多数为高级别胶质瘤)中，使用超低WGS拷贝数，我们能够在9/46份CSF样本、3/230 18份血浆样本和0/153份尿液样本中检测到分子改变。 弥漫性中线胶质瘤在儿童中更为常见，其特征是H3组蛋白基因的H3K27M突变，数字PCR分析了NCT03416530试验中患者CSF 的cfDNA和血浆中的H3K27M 20突变。CSF中的突变等位基因频率(MAF)降低与无进展生存期(PFS)延长相关 (p<0.004)，而MAF升高≥25%可预测一半患者的血浆和CSF中的疾病进展。 细胞外囊泡 对血浆来源的细胞外囊泡(EVs)货物(包括免疫球蛋白)进行的机器学习分类显示，在检测非起源于脑的同癌症时，敏感度为95%，特异度为90%。初步证据支持EV在胶质瘤诊断和临床随访中的作用。脑膜瘤释放大量的EVs，手术后EVs的数量减少。来自脑膜瘤培养物的体外EV DNA反映了肿瘤起源的遗传、表观遗传和突变情况。 胶质母细胞瘤(GBM)患者的EVs有助于预测手术前后肿瘤体积的镜像改变，并表达特异性GBM标志物。它们含有EGFRvIII，有趣的是，von Willebrand因子的含量显著高于健康对照。 EVs可能在GBM免疫环境中发挥一定作用。外泌体是一种EVs，可转运TGF-β (GBM产生的一种主要免疫抑制细胞因子)。在接受树突状细胞疫苗接种的患者队列中，血浆外泌体中的IL-8(以及TGF-β) mRNA与对胶质瘤抗原的免疫应答呈正相关。另一方面，GBM患者CSF中的外泌体含有LGALS9配体，LGALS9配体通过与树突状细胞的TIM3受体结合，抑制树突状细胞的抗原加工和呈递。最近的数据表明，EVs介导的GBM和自然杀伤细胞的相互作用表明，循环免疫囊泡“携带独特的肿瘤特异性信号”。 EVs在外周血或脑脊液中对脑肿瘤的诊断或临床随访的重要作用需要更多的数据。例如，在GBM患者中，血浆和血浆源性EVs中的qalectin-3结合蛋白水平显著高于健康对照，但在预测患者死亡率方面，血浆中的检测准确性显著高于血浆EVs(分别为75% vs. 45%)。 表2根据发表顺序列出的关于提示细胞外囊泡可能用于原发性和继发性CNS 2肿瘤患者的预后分层和肿瘤监测的液体活检的研究。
循环肿瘤细胞 在原发性脑肿瘤的外周血中存在循环肿瘤细胞(CTC)。早在多年前就有报道，但其稀缺限制了其临床应用。相反，在髓母细胞瘤和柔脑膜转移 (LM)患者中，选择CSF中的CTC可在疾病分期和随访中发挥相关作用。在LM中，95份样本中有43份检测到CSF-CTC, 1份CSF-CTC/mL提供了具有高敏感度和特异度的诊断阈值。基于上皮细胞黏附分子(EpCAM)的免疫流式细胞术在疑似LM患者脑脊液中检测CTC 的敏感性高于细胞学的(94% vs 76%)。脑膜脑炎患者接受质子全脑全脊髓照射时，存在3 ml CSF中CTC<53与较长的PFS相关(12个月vs. 6个月;P<0.01)。然而， cfDNA显示了更高的突变率 (43.6% vs 19.8%)和MAF (41.1% vs 13.0%;p 0.0001)显著高于CTC。 追踪胶质瘤的空间异质性和分支进化 胶质瘤和GBM是由几个具有不同遗传和转录谱的克隆细胞群组成的异质性肿瘤。因此，单个区域获得的活检样本可能不能代表整个肿瘤，而液体活检可能提供更全面的肿瘤分子谱。在浅WGS研究的胶质瘤中，在CSF cfDNA中检测到分子改变，而在相应的手术标本中未检测到。在胶质瘤中，34%通过靶向测序发现的突变仅在CSF中检出。 在烷化化疗的选择压力下，GBM细胞发生超突变和分支克隆进化。由于只有一小部分GBM患者在复发后接受二次手术，因此正如脑干儿童胶质瘤的初步证据所提示的那样，液体活检提供了重新评估肿瘤分子谱，并在血浆和脑脊液中监测肿瘤演变的机会(表1)。这是RANO(神经肿瘤学应答评估[Response Assessment in neurooncology, RANO])联盟的液体活检工作组提出的临床相关观点。 最近，有证据表明液体活检可能也具有预后作用，因为CSF中检测出的肿瘤cfDNA是总生存期(OS)降低的强独立预测因素。在血浆中，对42例GBM患者进行的第一项研究表明，24个较短的无进展生存期与cfDNA高于13.4 ng/ml之间存在相关性。在随后的一项对62例GBM的更大规模研究中，使用了更高的阈值(25.2 ng/ml)，较高的cfDNA值也与较短的总生存期相关。另外27例GBM患者队列的数据对这一观察结果提出了质疑，这些数据显示cfDNA水平与疾病进展相关，但术前cfDNA水平与生存期无相关性(表1)。 表1按发表顺序列出对提示可能用于原发性和继发性CNS肿瘤患者的疗效评估和预后分层的基于cfDNA的液体活检相关研究的选择。
确定治疗靶点 虽然在胶质瘤患者中，可用于靶向治疗的分子改变数量有限，但无创识别这些改变的潜力很有吸引力。对原发性脑肿瘤患者队列进行的研究表明，在18% - 24%的患者中，可从血浆cfDNA中识别出可采取措施的遗传改变(包括IDH1、BRAF、EGFR和NRAS突变)。 液体活检也可考虑用于脑转移瘤的靶向治疗，脑转移瘤在原发肿瘤的遗传特征和免疫微环境方面表现出差异。例如，通过将EGFR突变确定为EGFR抑制剂耐药的干预机制，液体活检可能为快速转换治疗方案提供了机会。 CSF中的MAF随着治疗应答而降低，而在复发时升高，这一观察结果进一步证实了基于CSF的液体活检的潜力。 在血浆液体活检中的“背景噪声（background noise） cfDNA水平可在白天和有压力时发生变化。 解读血浆液体活检结果时的一个混杂因素是克隆性造血( clonal hematopoiesis，CH) ，它可能导致造血干细胞中非肿瘤体细胞突变的累积。如果在cfDNA分析中将其解读为肿瘤相关遗传改变，则可能导致不适当的治疗决策。CH突变在一般人群中相当常见，与衰老(9.5-18.4% 21 > 70岁)、既往放疗或化疗以及发生血液系统恶性肿瘤和心血管疾病的风险增加相关。它们主要包括表观遗传调节剂(DNMT3A、TET2和ASXL)的突变，以及实体瘤 (KRAS、GNAS、NRAS和PIK3CA)和血液肿瘤(JAK2、PPM1D、TP53、25 SF3B1、SRSF2、IDH1和IDH2)中经常发生改变的基因的突变。由于CH，如果在胶质瘤患者血浆来源的cfDNA中发现IDH1和IDH2突变，可能需要通过对白细胞(和肿瘤组织，如果有的话)的DNA进行测序来研究它们的起源。在接受检测的18例患者中，有17例在外周血中发现突变，而在肿瘤组织中未发现突变，这证实了CH的相关性。值得注意的是，放化疗后CH的发生率较高，并且与较短的OS相关。 在神经肿瘤学中产生背景噪声的其他因素包括静脉血栓栓塞、炎症、脓毒症和创伤。在脓毒症患者的血浆中，髓过氧化物酶(一种由活化的中性粒细胞释放的酶)的水平与cfDNA的数量呈正相关。NETosis是细胞死亡的一种特殊形式，即活化的中性粒细胞在炎症、感染或缺氧的情况下释放中性粒细胞胞外诱捕网(NETs) 。研究发现，活化中性粒细胞释放的髓过氧化物酶与脓毒症患者的cfDNA水平显著相关。NETosis也可能是红斑狼疮和类风湿关节炎等自身免疫性疾病中cfDNA释放增加的潜在原因。 在神经肿瘤学中也观察到癫痫发作患者的血液中cfDNA增加。这在2013年就有了信号:患者和对照之间的cfDNA浓度差异有限，但达到了统计学显著性。然而，数值明显高于预期(微克/毫升而不是纳克/毫升)，表明存在污染的核DNA。在其他患者队列中进行确认将有助于验证这些观察结果。 在神经肿瘤学中增加液体活检的临床转化 绝大多数肿瘤cfDNA不包含肿瘤定义突变。另一方面，表观遗传特征在基因组中广泛分布，它们的进化受细胞分裂数量的调节，就像衰老和癌症一样，在这些疾病中，DNA甲基化缺失变得更加频繁。基于机器学习(ML)方法对CNS肿瘤进行了基于DNA甲基化的分类，这充分说明了甲基化分析在脑肿瘤诊断中的潜力。利用基于甲基化的高级测序技术，我们可以从循环cfDNA中识别出特异性甲基化标签，并对脑肿瘤进行准确分类。另一组得到了类似的结果，他们开发了一种ML算法，根据cfDNA衍生的甲基化标签区分有或无胶质瘤的患者。在体外，表观遗传学分析也被用于表征胶质瘤EVs的DNA货物。在体内，EVs可能由胶质瘤的神经元样亚群通过微管与周围的正常星形胶质细胞和神经元相互连接释放，这是有利侵袭的关键策略。GBM患者的EVs较对照组丰富，其蛋白货物可能提示GBM生物学。 值得注意的是，血小板具有摄取来自胶质瘤细胞的含有分泌RNA的膜囊泡的能力。最近的数据表明，基于肿瘤相关血小板(TEP) RNA的血液检测可检测18种癌症。在GBM中的检出率为51%。如上所述，BBB限制了生物标志物(如cfDNA)从脑肿瘤脱落到血流中，从而妨碍了传统检测方法对这些标志物的检测。经颅MR引导聚焦超声(MRgFUS)可一过性打开BBB ，从而为以更低的侵袭性方式进入脑部病理提供了机会。Meng等在9例GBM患者中首次进行了概念验证，发现MRgFUS急性增强了血浆.cfDNA(2.6±1.2倍，p<0.01, Wilcoxon符号秩检验)。 人工智能 人工智能(AI)，特别是ML，在详细阐述液体活检获得的数据方面也显示出巨大的潜力。例如，在结直肠癌患者 (n=72)中，在预测OS方面，结合17个CTC、外泌体和cfDNA分析的ML算法获得的多模态液体活检优于三种生物标志物。值得注意的是，在对20个相同样本进行训练的10个机器学习分类器中，利用全基因组甲基化测序的ML生成的分类器显示出最高的检测敏感度。 “上游”大小选择(cfDNA片段组学的一个例子)有助于富集通常比正常cfDNA片段短的肿瘤cfDNA 。通过在计算机模拟DNA 中选择长度为90- 150碱基对的片段，Moulière及其同事在约95%的病例中实现了肿瘤cfDNA中位富集超过2倍，从而提高了血浆cfDNA中临床上可采取措施的突变和拷贝数改变的检出率。 此外，ML引导下提取脑肿瘤的MRI特征(表征其纹理)可补充cfDNA获得的定量数据，从而改善临床随访和治疗决策的理论基础。 突出的问题 在之前的报告中，基线CSF cfDNA浓度与生存期2呈负相关，且与人口统计学或临床病理数据无关15血浆cfdna也有类似趋势3这提出了一种有趣的可能性，即cfDNA的释放取决于肿瘤的内在生物学特征，而不仅仅取决于肿瘤的大小。因此，为了在解读液体活检数据方面取得进展5，我们需要更深入地了解cfDNA释放到CSF或血流中的机制6。核小体排出过程可能是外周cfDNA增加的一个相关机制8，值得进一步研究。不同的基因负责核小体9排出和随后的染色质重塑，从而增加DNA延伸10的可用性，从而与基因组的启动子或增强子区域的转录因子相互作用。溴结构域蛋白4 (BRD4)就是这样一个因子，它通过使维持核小体稳定性的关键残基H3 K122.110乙酰化来促进核小体的清除12。值得注意的是，BRD4也通过维持14号染色体的三维相互作用来增强相互作用，在GBM中过表达，并且与其他BET溴结构域蛋白一起是GBM增殖所必需的。 与胶质瘤生物学高度相关的另一种机制是缺氧。内皮一氧化氮合酶转录的缺氧抑制与核小体排出耦联。在低氧诱导的启动子中，核小体被低氧诱导的转录因子排出，可建立核小体游离DNA区域(nfr)，核小体在复氧数小时后可发生再组装NFR是活性基因启动子中染色质的典型结构，每个启动子区域的NFR包含100 ~ 500 碱基对，对应1 ~ 2个核小体。 最后的评论 图2总结了液体活检在神经肿瘤学中的现状。当不建议手术时，对CSF的分析可提供鉴别诊断的信息27，或对鉴别诊断无帮助。血浆更易于临床随访，有助于解读组织微环境对脑肿瘤的调节作用和治疗挑战。三个层面的技术进步都有可能提高血浆cfDNA提供信息的潜力:甲基化分析、暂时的血脑屏障破坏和增加对肿瘤cfDNA脱落生物学的认识。
图2对cfDNA进行血浆(图左侧)和CSF(图右侧)液体活检的优点和注意事项。血浆和CSF都可能是脑肿瘤在体液中释放的遗传物质的宝贵来源。一方面，静脉采血比脑脊液抽吸创伤小，在临床随访中，即在常规门诊就诊时，容易重复采血;另一方面，CSF通常含有较多的肿瘤来源的遗传物质和较少的正常细胞释放的遗传物质，导致较高的突变检出率。此外，血浆中的cfDNA总量也可能由于干预情况(例如静脉血栓栓塞、炎症、脓毒症、局灶性癫痫)而一过性增加，在解读结果时应考虑到这一点。缩写:cfDNA =游离DNA;EVs =细胞外囊泡;CTC =循环肿瘤细胞;CNVs=拷贝数变异。 文献检索 以"液体活检"、"游离DNA "、"胶质瘤"、"脑转移瘤"、"液体活检与脑脊液"、"液体活检与血浆"（ “liquid biopsy”, “cell free DNA”, “glioma”, “brain metastases”, “liquid biopsy and CSF”, “liquid biopsy and plasma”）为检索词，检索PubMed数据库，并结合相关文献进行分析。会议的摘要和报告未被纳入。仅纳入1977年至2023年3月8日发表的英文文章。 |
|
|
