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基因治疗流程及分类 基因作为遗传物质的基本单位，具有控制遗传性状表达和活性调节的作用。基因治疗可以通过基因转移或基因调控等方法，将带有治疗性的基因导入患者体内，纠正或补偿异常基因缺陷以达到治疗疾病的目的。 基因治疗的流程分为：目的基因制备、载体构建、细胞转染、外源基因表达和检测。 ★ 目的基因制备：确定用于治疗疾病的目的基因 ★ 载体构建：载体负责将外源基因运输到细胞内，载体分为病毒载体和非病毒载体 ★ 细胞转染：基因可通过病毒感染、物理方法、化学方法等导入靶细胞，目前转染率无法达到100%，需进行筛选（标记基因筛选法、基因缺陷型受体细胞的选择性、基因共转染技术） ★ 外源基因表达和检测：鉴定转导细胞中外源基因的表达状况。其中包括对目的基因和标记基因表达的鉴定（原位杂交、Northern杂交、NRA打点杂交、免疫组化染色） 基因治疗可根据实现手段的不同分为离体治疗和体内治疗两大类。疾病产生部位、体内细胞的获取难度等因素共同决定了是采用体内方法还是体外方法。 ★ 离体基因治疗：从患者体内分离细胞，将整合载体在体外导入这些细胞，进行基因工程改造，随后再回输到患者体内。需要采集患者的细胞进行处理后再回输，因此难以规范化生产，主要针对血液病，如治疗β地中海贫血的Zynteglo ★ 体内基因治疗：分为基因替代（补充治疗性基因）和基因编辑（敲除或纠正错误基因）。将非整合载体直接注射给患者，使得功能性矫正基因被递送至患者体内，恢复疾病正常表型 两者各有其优缺点。离体基因治疗利用自体细胞，不会产生免疫反应；同时还可在体外筛选到高效转导以及无脱靶的细胞，但有制备步骤繁琐，细胞活力低等缺点。在体基因治疗操作简便，对于一些体外无法培养的细胞类型是最优选择。但由于体内编辑的不确定性，无法避免很多随机整合或脱靶等事件，并且一些病毒载体还会使机体出现危及生命的免疫反应。
基因治疗的2种方式（体外-左；在体-右）
基因治疗载体的选择 基因导入系统（gene delivery system）是基因治疗的核心技术，载体的选择是基因治疗成败的关键。理想的载体需具备以下特点： ★ 有足够的空间来递送大片段的治疗基因 ★ 具有高转导效率，能感染分裂和非分裂的细胞 ★ 能靶向特定的细胞，且可以长期稳定表达转基因 ★ 具有较低的免疫原性的或致病性，不会引起炎症 ★ 具备大规模生产的能力 基因治疗载体一般分为病毒载体系统和非病毒载体系统，病毒是最常用的基因载体。目前最为常用的病毒载体包括腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）、慢病毒（Lentivirus，LV）、腺病毒（Adenovirus，AdV）和逆转录病毒（Retrovirus，RV）等，其他还有单纯疱疹病毒载体、豆苗病毒载体、溶瘤病毒载体等；非病毒载体主要包括脂质体、质粒等。
2018 年基因治疗管线中载体使用情况
已上市基因治疗药物
1. Gendicine（今又生）是全球首个获批的基因治疗药物，由深圳赛百诺开发，用于治疗携带p53基因突变的肿瘤患者。Gendicine是一种携带野生型p53基因的复制缺陷型腺病毒(Ad-p53)，可通过刺激肿瘤细胞中的凋亡途径，增加肿瘤抑制基因和免疫应答因子的表达进而杀伤肿瘤。CFDA于2003年10月批准了Gendicine用于头颈部鳞状细胞癌的治疗。 2. Oncorine（安柯瑞）是另一种携带p53基因治疗头颈癌的基于复制缺陷ADV的药物，于2005年在中国上市，由上海三维生物开发。Oncorine是通过重组的方式删除人5型腺病毒E1B-55kD和E3区部分基因片段而获得的一种溶瘤性腺病毒，它可在p53功能缺陷的肿瘤细胞中选择性复制而诱导肿瘤细胞死亡，而不会对正常细胞产生明显毒副作用。 3. Rexin-G是一种嵌合逆转录病毒载体，装载有细胞杀伤性显性负性的细胞周期蛋白G1基因以靶向并杀死实体肿瘤，于2005年获得菲律宾FDA的批准。 4. Neovasculgen 2012年，俄罗斯批准Human Stem Cell Institute的产品Neovasculgen上市，用于治疗末梢血管病和肢体缺血。 5. Glybera是由UniQure公司研发的的脂蛋白酶缺乏症(LPLD)基因疗法，它2012年10月获得欧盟药物管理机构批准，2014年正式上市，是第一个被欧盟批准上市的基因治疗方法，推出时该药物在德国的销售成本约100万美元/治疗。2017年10月份Glybera的销售许可证到期之前UniQure宣布不再重新申请销售许可，该药物因上市四年只有一人使用而退出市场。 6. Imlygic（T-VEC）2015年，FDA批准安进公司的溶瘤病毒疗法Imlygic上市，该疗法运用基因改造技术修饰单纯疱疹病毒1，使其具有更强的肿瘤杀伤能力，用于治疗病灶在皮肤和淋巴结且没能通过手术完全清除的黑色素瘤，这是美国批准的第一个运用基因改造技术的产品。T-VEC在欧洲和澳大利亚已被批准用于黑色素瘤的治疗。 7. Spinraza由百健(Biogen)与Ionis制药公司合作开发，为首个批准用于治疗罕见且致命的脊髓性肌萎缩症（SMA）的治疗方法。Spinraza是一种反义寡核苷酸（ASO），可改变SMN2基因的剪接，增加全功能性SMN蛋白的生产。Spinraza在国外的治疗费用相当昂贵，定价12.5万美元/针，首年需要6次注射，治疗费用为75万美元，第二年的费用降低一半至37.5万美元。该疗法已于19年2月在国内获批。 8. Strimvelis是GSK研发的一种基于逆转录病毒用于治疗超罕见的免疫缺陷综合症（ADA-SCID）的药物，于2016年5月被EMA批准上市，定价59.4万欧元。是第一个用于治疗ADA-SCID的体外干细胞基因疗法，也是第二个被欧盟批准上市的基因疗法。Strimvelis通过从患者的骨髓中取出干细胞，通过转导将一个正常拷贝的ADA基因导入干细胞，然后采取静脉输注将干细胞重新导入患者体内，之后一部分干细胞会归巢至骨髓。 9. Zalmoxis由意大利MolMed公司研发，是另一种基于供者来源T细胞的自杀基因免疫疗法，于2016年被EMA有条件性批准用于治疗部分白血病和淋巴瘤。该方法使用RV遗传修饰异体来源的T细胞以表达1NGFR和HSV-TK Mut2自杀基因，因而可以随时使用更昔洛韦（ganciclovir）药物杀死引起不良免疫反应的T细胞。带有“自杀基因”的T细胞表达前药转换酶HSV-TK，后者可磷酸化激活更昔洛韦的细胞毒活性，从而诱导T细胞“自杀”，防止可能出现的GVHD进一步恶化。 10. Kymriah由宾夕法尼亚大学和诺华公司共同研发，是一种基于慢病毒的嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）来治疗非霍奇金淋巴瘤（NHL）和B细胞急性淋巴细胞白血病（ALL）患者的基因疗法，于2017年8月被FDA批准上市。它使用患者自身重编程的T细胞编码转基因CAR来鉴定和消除表达CD19的恶性和非恶性肿瘤细胞，整体的治疗缓解率可达83％。 11. Yescarta是另一种基于逆转录病毒的CAR-T细胞免疫疗法，由吉利德开发，于2017年10月获得FDA批准。使用NHL患者自身T细胞并使用RV进行遗传修饰以产生与CD28和CD3-zeta共刺激结构域连接的抗CD19的CAR，以帮助对抗淋巴瘤。 12. Luxturna于2017年12月被FDA批准作为治疗Leber先天性黑朦的孤儿药，也是首个用于治疗失明的基于病毒类的药物。携带有野生型RPE65的AAV2被用于治疗双等位基因RPE65突变相关的视网膜营养不良的患者，可在几个月内恢复视力。 13. Collategene 2019年2月，日本厚生劳动省在批准Kymriah的同时批准了本国公司AnGes生产的基因治疗产品Collategene，用于治疗在标准药物治疗后无效的闭塞性动脉硬化症和血栓闭塞性脉管炎，这是被日本官方批准的第一款基因治疗产品。 14. Zolgensma 2019年5月，FDA批准诺华旗下的AveXis 公司的Zolgensma，用于治疗2岁以下儿童的脊髓性肌萎缩症，Zolgensma的定价为每剂212.5万美元，成为有史以来最昂贵的药物。 15. Zynteglo是由Bluebird Bio开发的一款基于慢病毒的自体干细胞疗法，于2019年6月获得EMA有条件批准用于治疗12岁及以上的非β0 /β0基因型输血依赖性β-地中海贫血(TDT)患者。临床数据显示，该疗法可以使特定基因型TDT患者免于输血长达3.8年。
小结 ★ 基因治疗本质上是一个目的基因、载体和转染的问题，基因载体是基因治疗成功的关键。安全性高，容量大，转染效率高，长期稳定表达的特异靶向性的新型载体，是基因载体研究的方向。 ★ 基因药物开发的费用不菲，评估其潜在价值比较困难，如何定价、谁来买单的问题难以解决。 ★ 期待未来基因疗法将从罕见病领域推广至大病种，发挥更大的社会价值与资本收益。 参考文献： [1] 细胞和基因治疗 CDMO， 下一个快速增长的新赛道，广发证券 [2] Gene Therapy，The New England Journal of Medicine [3] 2019年我国基因治疗载体行业发展现状，火石创造 [4] 基因治疗发展历程概述与展望, 精准医药GETG |
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