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研究背景：

以有氧糖酵解和线粒体氧化磷酸化功能障碍为特征的能量代谢重编程是癌症发生中的重要标志。线粒体膜转运蛋白位于线粒体内膜内，可作为代谢底物的载体，下图A详细阐述了线粒体SLC25所携带的代谢底物及在线粒体中的相关生物过程。SLC25编码了53个转运蛋白。DNA突变或SLC25的异常表达会通过异常代谢导致癌性疾病和非癌性疾病。在该研究中，作者使用公共数据库的数据集，全面解析了SLC25的遗传改变和转录组改变。然后，分析了SLC25的差异表达成员(DEMs)及其功能和肿瘤免疫浸润，并构建了预后风险模型。最后，在临床标本中验证了此结论，并探索了SLC25A5在结肠癌来源的细胞系中的功能。

研究流程图：

研究结果：

一、结肠癌中线粒体SLC25家族的差异基因

1、从结肠癌数据集（GSE17636）和正常结肠数据集（GSE39582）中鉴定出37个DEMs(图2A)。

2、采用Spearman秩相关检验(图2B)检测了差异基因在转录水平上的相关性，并用蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络说明了蛋白质水平上的交互关系(图2C)。

3、为了确定DEMs与临床参数之间的相关性，我们研究了37个dem的表达水平与临床分期和预后之间的关系。发现SLC25A3、SLC25A4、SLC25A5、SLC25A17、SLC25A24、SLC25A37、SLC25A42、SLC25A46、SLC25A48和SLC25A51与临床分期相关(图2D)。

4、SLC25A5和SLC25A24的高表达表明结肠癌患者的生存时间更长(图2E)。

二、线粒体SLC25 DEMs的遗传变异和转录组改变对结肠癌患者的临床预后预测价值

1、利用cBioProtal，发现SLC25A4、SLC25A5、SLC25A24、SLC25A34、SLC25A3、SLC25A51、SLC25A44、SLC25A12、SLC25A32和SLC25A15在结肠癌患者中表达高于健康个体 (图3A)。

2、Kaplan-Meier曲线显示，DEMs基因改变的患者总生存时间较长。外显子跳跃是SLC25的DEMs中选择性剪接事件(ASEs)的主导类型(图3c)。

3、在23对人类染色体对上，DEMs中CNV改变的位置（图3D）。

4、SLC25A5高表达的患者对ROCK抑制剂GSK269962A和福替尼表现出显著的高敏感性。SLC25A24的上调增加了坦桑霉素、曲美替尼和瑞福美替尼的耐药性。

三、基于线粒体SLC25 RNA表达，建立结肠癌风险模型

为了进一步量化SLC25对所有病例预后的影响，作者构建了一个新的风险评分模型。经过LASSO回归分析，37个DEMs中有13个被确定为最有价值的预后预测因素，其中8个纳入Cox比例风险模型。然后，由这8个DEMs计算TCGA中每个病例的风险评分。根据Kaplan-Meier曲线显示，高危评分高的患者OS时间相对较短(图4a)。

四、高危评分与增强免疫浸润的表型、肿瘤糖酵解和凋亡水平以及患者的预后价值相关

1、高危组病例显示以肿瘤免疫浸润增加为特征（图4b）。高危组患者的免疫评分明显高于低危组(图4c)。

2、在高危评分患者中，糖酵解活性(图4d)和凋亡通路活性(图4e)受到抑制。

3、风险评分作为预测结肠癌患者预后的独立危险因素，采用多变量Cox回归和多变量Cox回归分析进行整体分析分析(图4f)。

4、构建了一个包括临床病理特征，如年龄、性别、分期等，以评估TCGA病例的预后(图4g)。

通过计算c指数，在TCGA和GEO队列中，列线图均表现出良好的识别性能。列线图的校准曲线表明，在TCGA和GEO数据库中，估计结果与结肠癌患者的实际观察临床结果之间存在最佳一致性(图4h)。

五、SLC25A5和SLC25A24在结肠癌中的生物信息学分析

1、基于TCGA-COAD样本，两者在结肠癌中均表达较低(图5A)。

2、关于结肠癌的诊断效果，SLC25A5的ROCs的AUC为0.773，SLC25A24为0.771 (图5b)。然后，根据SLC25A5和SLC25A24的中位数表达值，将所有病例重新分组为重度低表达亚型。

3、从中鉴定出409个和378个DEMs，图5c中的火山图显示了DEMs中上调的前16个DEMs。

4、.同时，鉴定出1152个和4403个共表达基因，其中649个与SLC25A5正相关，459个呈负相关。3867个与SLC25A24正相关，136个呈负相关。前8个共表达基因如图5d的热图所示。

5、通过SLC25A5和SLC25A24表达鉴定的DEGs富集的前三个GO项和KEGG通路如图5e所示。

6、参与代谢的基因集，如HALLMARK_GLYCOLYSIS和HALLMARK_ADIPOGENESIS，通过SLC25A5和SLC25A24的差异表达水平而富集(图5F)。

7、SLC25A5的表达与CD8+T细胞的浸润负相关，和中性粒细胞正相关，而SLC25A24的表达与CD8+T细胞的浸润，中性粒细胞，B细胞和巨噬细胞正相关 (图5G)。

六、验证SLC25A5和SLC25A24在临床标本中的细胞内定位、表达、预后价值和肿瘤免疫浸润

1、SLC25A5和SLC25A24的细胞内定位(图6a)。

2、与正常结肠上皮细胞相比，结肠癌中SLC25A5和SLC25A24低表达(图6b)。

3、Kaplan-Meier曲线提示SLC25A5和SLC25A24高表达的患者OS较长(图6c)。单因素和多因素Cox回归分析提示SLC25A5是一个独立的预后因素，而SLC25A24不是。

4、免疫组化染色分析表明，SLC25A5的表达与CD8的表达呈负相关，而SLC25A24的表达与CD19的表达呈正相关 (图6d)。

七、结肠癌来源细胞系中SLC25A5功能表型的验证

1、选择1个人类结肠上皮细胞系和7个结肠癌细胞系检检测SLC25A5表达。在HCT-116和RKO细胞中表达较低（图7A）

2、SLC25A5和SLC25A24在HCT-116和RKO细胞中过表达效率的验证 (图7B, S6B)。

3、通过CCK-8和克隆形成检测SLC25A5和SLC25A24对细胞增殖水平影响，发现过表达SLC25A5，而不是SLC25A24，导致了肿瘤发生能力的抑制。EdU（图7E）和TUNEL（图7F）染色及定量（图7G、H）显示细胞增殖和凋亡情况。当SLC25A5过表达时，与程序性细胞死亡相关的生物标志物，如Caspase-1、IL-1β、IL-18和GSDMD的表达增加（图7I）。

八、验证SLC25A5在糖酵解、脂质代谢和癌症相关细胞信号通路方面的GSEA结果

1、过表达SLC25A5时，ENO-1、IDI-1、HMGCR 高表达，EBP和MVD低表达（图8A）。

2、通过JC-1染色检测线粒体膜电位(MMP)的变化（图8B）。

3、由于SLC25A5低表达与高表达患者的HALLMARK_KRAS_SIGNALING_UP特征不同(图8c)， MAPK级联蛋白水平（特别是p-MEK1/2和p-Erk1/2）被显著下调(图8d)。

4、在过表达SLC25A5的HCT116和RKO细胞中，MAPK信号通路激活抑制细胞凋亡(图8E，F)，促进细胞增殖(图8G)。在PDBu存在时，p-MEK1/2和p-ErK1/2的蛋白水平增加(图8h)。这些结果表明，SLC25A5通过MAPK信号通路抑制了肿瘤的发生。

总结：在该研究中，作者使用公共数据库的数据集，全面描述了SLC25家族在结肠癌中的遗传变异和转录组改变。然后，分析了SLC25的差异表达成员(DEMs)及其功能和肿瘤免疫浸润，并构建了预后风险模型。此外，还在临床标本中验证了该发现，并探索了已鉴定的成员(SLC25A5)在结肠癌来源的细胞系中的表达及功能。