可逆终止子 – Illumina统治NGS行业十数载的基石！

中学课本已经告诉我们DNA是由脱氧核糖核酸（dNTP）组成的（2'-脱氧核甘-5'-三磷酸），DNA链由5'-单磷酸酯连接形成，而DNA的碱基由互补配对的A-T和C-G组成。

上世纪70年代末，英国的生化学家弗雷德里克·桑格（Frederick Sanger）提出测定DNA序列 “双脱氧终止法”，通过使用2’-,3’-双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）阻断DNA聚合反应，这被称为第一代DNA测序技术。随后，又通过在碱基上连接相应的荧光基团，实现了四种ddNTP更容易的区分，把桑格测序带入了自动化时代，推动了人类基因组计划的实施。

桑格双脱氧链终止反应

人们对于速度和通量的追求推动了大规模并行测序技术，也就是所谓的下一代测序（NGS）。在桑格测序中作为链终止子的双脱氧核苷酸的使用，为应用到NGS到核苷酸 3' 末端可逆封闭基团的开发提供了参考。

现行的大多数测序是通过DNA聚合酶可以掺入核苷酸发生聚合延伸反应的天然属性来实现的，而掺入合成反应中的不同核苷酸的特异信号（如标记不同颜色的荧光基团）可以被用来推断互补的靶标核酸序列。所以，在实施的过程中，既需要保证DNA聚合反应的进展，又要确保有可行的机制来查询每次插入的核苷酸。在ddNTP的基础上实现反应的可逆终止就变成了一个有效的思路。

循环可逆终止反应就是使用可逆终止子进行的循环反应，进行核苷酸掺入、荧光成像和切割。可逆终止子就是特殊修饰的核苷酸，核心就是使用颜料标记和具有阻止延伸反应的基团，理想情况下，可被特异性掺入，在荧光成像期间或者之后被有限切割，切割后可以成为修饰碱基或者天然碱基进行延伸。

循环可逆终止测序示意

主要的可逆终止子有两种类型：3’封闭和3’未封闭。

目前被广泛使用的3'封闭基团包括 3'-O-烯丙基（哥伦比亚大学Jingyue Ju教授首先开发，先是将技术独家授权给 Intelligent Bio-Systems，被Qiagen收购后，由于和illumina的官司等，战略放弃了GeneReader测序仪的开发；后相关专利独家授权给了Singular Genomics，成功开发并推出了G4平台）和 3'-O-叠氮甲基（Illumina/Solexa，通过上文可以知道华大测序平台也在使用这一封闭基团，暂时没有替换的计划）。3'-封闭的终止子需要切割两个化学键才能从碱基上去除荧光团并恢复 3'-OH 基团（理想情况下，可使用同一种试剂在相同的反应条件下同时去除这两个基团）。如，Illumina/Solexa在裂解步骤中使用还原剂三（2-羧乙基）膦 (TCEP)再生 3'-OH 基团。

由于天然的DNA聚合酶不能有效掺入并结合3'端封闭的修饰核苷酸，所以配合修饰核苷酸的使用，需要筛选突变型高效聚合的酶。而这也刺激了3’不封闭的可逆终止子的开发。在历史上，Helicos等公司报告过这样的修饰核苷酸，这些3'-未封闭的终止子依靠庞大的染料基团的空间位阻来抑制下一个核苷酸的掺入。3'-未封闭的可逆终止子甚至可以使用野生型 DNA 聚合酶像天然核苷酸一样掺入。同时，只需要切割一个单键即可从碱基上去除终止基团或抑制基团和荧光基团，这比 3' 封闭终止子更高效。（实际上，Helicos的四种核苷酸都标记了相同染料，通过循环单色成像来推断序列。）

与终止DNA聚合反应不同，PacBio所提供的技术方案是实时测序，涉及在 DNA 合成过程中对染料标记的核苷酸的连续掺入进行成像。荧光团被连接到末端磷酸基团而非而不是核碱基上，这也减少了与 DNA 聚合酶结合的偏差。单个 DNA 聚合酶分子被附着在单个零模式波导检测器（ZMW）的底面上，通过掺入结合磷化核苷酸所停留的时间及模式实现四色实时测序。

3’封闭（a） 及3'-未封闭（b）的可逆终止子，以及实时测序用的修饰核苷酸（c）。

注：图中，红色化学结构代表封闭基团，箭头表示将荧光团与核苷酸分开的切割位点，蓝色化学结构表示残留的接头结构或分子疤痕。

尽管循环可逆终止子测序推动了高通量测序的发展，但最明显的一个问题就是读长短，这可能的一个原因就是这些可逆终止子核苷酸类似物在携带荧光团的接头切割后留下了“疤痕”（如上图中蓝色标记部分）。伴随引物延伸，这种疤痕堆积如滚雪球，可能会影响到DNA双螺旋结构的稳定性，从而阻碍底物识别和引物延伸。

Illumina测序中疤痕的积累示意图，蓝色的化学结构表示留下的分子疤痕沿着DNA 双链的大沟积累。

就如之前文章中所写的，通过添加一定比例的不带荧光团的可逆终止子，一些碱基的掺入不留痕迹，一定程度上缓解了疤痕堆积的影响，能部分延长读长并有效解决相位不同步的问题。后续一定会持续创新以出现疤痕更小的修饰核苷酸。而诸如Element Bio（详情点击：到底革新了哪些测序“元素” - Element Bio亲和力测序技术剖析）和Omniome那样将（1）核苷酸识别与（2）利用不带荧光基团的可逆终止子进行合成区分开的“两步走”SBS流程可能会逐渐验证其可能的优势？

持续关注。

参考文献：

https:///10.1016/j.gpb.2013.01.003

https:///10.1038/nrg2626 

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