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细胞愈伤组织形态的发生主要是受外植体本身、培养基和培养环境等三大类因素的调控。 愈伤组织 1 愈伤组织最初是指植物受到机械损伤时，在愈合伤口处长出的一团瘤状突起，该瘤状突起内的细胞相对于植物体内成熟体细胞已发生了脱分化的变化。这种创伤愈伤组织的概念后来被引入植物组织培养领域。愈伤组织现多指将植物体的某个部分切下，用做外植体，接种到适宜的培养基上培养，外植体组织增生而产生的一团脱分化的细胞组织。
植物外植体，如根、茎、叶、果实、子房、花粉、花瓣等各种器官或组织，当将其与母体分离并培养在含有适宜浓度植物激素的培养基上时，它们就可能转变为一种能迅速增殖的细胞团，即愈伤组织。然而，最近的研究发现，愈伤组织实际上也是一个有结构的、分化的组织，愈伤组织主要来源于一类特化的成熟干细胞群，并非所有的植物细胞。 可以说，所有的多细胞植物均具有诱导产生愈伤组织的潜在可能性。理论上讲，诱导愈伤组织成败的关键不在于植物材料的来源，而在于培养条件。其中，激素的成分和浓度是极为重要的因素。生长调节物质，特别是生长素，对于细胞分裂的诱导以及其后的生长和增殖都是必要的物质。细胞分裂素未必是必需的物质，然而，常常因不同的供试材料而异。例如，大豆根部，在只含生长素的培养基中，分裂细胞主要来自中柱鞘，相反，如果加入激动素，则皮层细胞也会被诱导而分裂。因此，即使是同一个器官，也会因不同组织而对激素的要求有所不同。 外植体的选择 2 （1）物种：不同物种的器官分化明显不同，如胡萝卜、烟草和矮牵牛等植物易诱导形成，而禾谷类、豆类、棉花等较难。 （2）器官和部位：通常同一种植物的不同器官或组织所形成的愈伤组织，无论在生理上或形态上，其差别均不大。但是对有些植物而言，确有明显差异。如油菜的花器比叶、根等易于分化成苗，水稻和小麦幼穗的苗分化频率也比其他器官为高。 （3）年龄： 年龄较幼的外植体，不仅易于诱导形成愈伤组织，而且也容易诱导分化成植株。年龄越老，当转移到分化培养基上生长时，其苗分化频率越低。因此在组织培养中，要及时转移已形成的愈伤组织进行分化培养，可大大提高苗的分化频率。 培养基 3 培养基的各种成分和物理性质，都对器官发生产生一定影响，但起决定作用的仍然是植物生长激素，特别是生长素和细胞分裂素的配比。 1、生长激素 腺嘌呤/IAA的比例是控制芽和根形成的重要条件之一，腺嘌呤/IAA比例高时，有利于芽形成。而这一比例低时，有利于根形成。 不同生长素和细胞分裂素，对生根和长芽的效果是不同的。如NAA对生根的作用比IAA和IBA的效果好，用IAA和IBA处理，产生的根比较健壮，而用NAA处理，产生的根则较纤细。KT和BA能广泛地诱导芽的形成，但BA比激动素ZT的效力大。玉米素的作用范围较窄，但对某些植物有特效。 2、无机营养元素缺乏或过多或不足也会影响细胞生长和分化。如生根培养要求无机离子浓度小一些。如有些植物要求的硝酸氮；而有些植物要求铵态氮。 3、有机成分 在培养基中加糖、VB1、VPP、VB2、肌醇和甘氨酸等，可以满足愈伤组织的生长和分化的要求。各种氨基酸和嘌呤、嘧啶类物质，可以促进器官分化。其中酪氨酸可明显增加烟草组织培养的器官形成。酰胺类往往有促进器官形成的作用。水解酪蛋白中含有多种氨基酸，促进器官分化。 糖的不同种类和浓度，对培养组织的增殖及器官分化均有明显影响。 加一些植物器官的汁液，如椰子汁、麦芽汁、酵母提取物、番茄汁、荸荠汁、马铃薯汁、青玉米汁等，它们不仅提供一些生理活性物质，而且也补充一些微量元素成分。其中用得最多且有效的是椰子汁。 4、物理性质 培养基的物理性质（固体状态或液体状态，渗透压和pH）对形态发生有明显的影响。 培养基中的渗透压，对细胞增殖和胚状体的形成都有十分明显的影响，在花药培养中受到普遍的重视。如油菜花药培养宜先放在高糖（9～10%）培养基中培养，有利于细胞增殖和胚状体的形成。 培养环境条件 4 1、光照 光对器官的作用是一种诱导反应。一定的光照对小苗的形成、根的发生、枝的分化和胚状体的形成有促进作用。 2、温度 在组织培养22～25℃的恒温条件，可较好地形成芽和根。很多实验也表明，温度的高低对器官发生的数量和质量仍有影响。 愈伤组织的诱导 5 从单个细胞或外植体上脱分化形成典型的愈伤组织，大致经历三个时期：启动期、分裂期和形成期(Petru,1974)。 5.1 启动期 启动期(initiation stage)又称为诱导期(induction stage)，是愈伤组织形成的起点。外植体已分化的活细胞在外源激素的作用下，通过脱分化启动而进入分裂状态，并开始形成愈伤组织。这时在外观上虽然未见明显变化，但实际上细胞内一些大分子代谢动态已发生了明显改变，细胞正积极为下一步分裂进行准备。细胞的合成代谢活动加强，迅速进行蛋白质和核酸等物质的合成。形成愈伤组织时，RNA及蛋白质的变化明显。一些研究发现，绿豆子叶形成愈伤组织的初期RNA含量明显增加，枸杞叶片接种后的12h过氧化物酶的活性就开始上升，到24h其酶活性又升高1倍。 通常情况下，接种的外植体细胞是处于静止状态的成熟细胞，一般不进行分裂。但静止细胞并未丧失其在分生组织状态时的那种分裂潜能，只是在分化过程中产生了一类抑制物抑制了其分裂的能力。如果去除这类抑制物质，就能使分化的体细胞恢复分裂活力。研究发现，这些抑制物质的作用是阻碍DNA复制，若加入消除抑制影响的物质，那么细胞就会立即进行复制，进入细胞分裂周期的S期，并发生同步分裂。然而，诱导植物细胞分裂，实际上要受很多环境因素的影响。机械损伤就是引起诱导组织细胞分裂的一种刺激因素。最新研究结果表明，伤口处AP2/SRF类转录因子WIND1迅速激活，上调细胞分裂素的响应，从而促进细胞去分化和增殖，最终形成多细胞团，也就是愈伤组织(Iwase etal，2011)。外源激素是一种能诱导细胞开始分裂的诱导剂，通常可以通过调整外源激素的种类和浓度来诱导细胞开始分裂。2,4-D处理静止状态的组织时，细胞的RNA含量明显增加，而且2,4-D可积累在分裂细胞的核仁中。在小麦成熟胚脱分化培养过程中，有80个生长素相关基因的表达发生了变化，这些基因涉及生长素的运输、响应、诱导、合成和降解等多个生物学过程(Chen etal，2009)，进而调控细胞基因的表达。分子和细胞证据显示，拟南芥中愈伤组织的形成并不是一个简单回复到未分化状态的过程(Sugimoto etal，2010)。 离体培养的成熟细胞在分裂前内部会发生一系列的变化。Yeoman和Evans (1967)在应用放射性自显影的方法观察菊芋的体外培养过程中发现，在培养开始后10～12h，首先DNA合成变得活跃，此后8h，约有40％细胞已经吸收了3H-胸腺核苷。RNA和蛋白质含量显著增加，这在活跃进行DNA合成的细胞中才可见到，而未参与分裂的细胞所发生的变化不显著。开始培养后20h左右，细胞核分裂指数增加，并且达到高峰，隔数小时后，可以看到细胞数急剧升高。 愈伤组织形成时，一般可以看到呼吸加剧及酶活力增强。呼吸系统的酶活性在最初呼吸强度升高期间几乎没有变化，经过24～48h后，其活性就表现出显著加强。这是因为在培养后较短的时间内，呼吸加速取决于组织细胞已经具备的酶，而且在不添加生长素(2,4-D)的培养基中也可看到酶活性同样提高。其后酶活性的增加，是在培养基中生长素的参与下诱导形成的。 5.2 分裂期 分裂期(division stage)是外植体切口边缘开始膨大，外层细胞通过一分为二的方式进行分裂，从而形成一团具有分生组织状态细胞的过程。外植体细胞一旦经过诱导，其外层细胞便开始细胞分裂，使细胞脱分化。这时组织细胞代谢十分活跃，发生了一系列生理生化及形态的变化。培养组织的细胞中RNA及其一些成分随着细胞的不断分裂而开始减少，最后细胞内这些成分的积累又和分裂达到一种协调状态，细胞的体积不再减小，内无大液泡，细胞核大，核仁明显。在这个继续分裂、RNA减少的过程中，DNA含量始终保持不变。由于细胞分裂的速率大大超过了细胞的生长速率，结果使每个细胞体积显著减小、鲜重下降，但细胞的数目迅速增加。例如，胡萝卜组织经过7d的培养后，细胞数可增加10倍。这些变化表明，原来已分化的细胞已经回复变化为具有分生状态的脱分化的细胞，这些大量分生状态的细胞团形成了愈伤组织。 5.3 形成期 形成期(formation stage)是指外植体的细胞经过诱导、分裂形成了具有无序结构的愈伤组织时期。这个时期的特征是细胞大小不再发生变化，愈伤组织表层的分裂逐渐减慢和停止，接着内部组织细胞开始分裂，细胞数目进一步增加。细胞分裂以平周分裂为主，从而使创伤形成层的细胞呈辐射状排列。在组织表面细胞分裂减缓和内部较深处细胞开始分裂的同时，分裂面的方向发生了改变，大量分裂的细胞冲出表层细胞，出现了类似于维管束或顶端分生组织的瘤状结构外表，从而使活跃生长的愈伤组织形成一种“泡状”增殖状态。 在愈伤组织的形成过程中，尽管在形态上可以划分出启动、分裂和形成三个时期，但实际这些时期的界限并不是十分严格的，尤其是分裂期和形成期，它们往往可以在同一组织块上观察到。所以，根据组织和细胞的形态、结构、大小以及一系列生理生化代谢水平划分三个时期，只是便于更好地了解愈伤组织生长时的相对状况。 愈伤组织的形态 6 根据外植体来源不同，愈伤组织可以发生自形成层、皮层、髓、次生韧皮部及木质部薄壁组织和表皮等。来自不同植物外植体的愈伤组织，其质地和物理性状差异很大。有的很紧密坚实，有的很疏松脆弱或呈胶质状；有的呈淡黄色，有的呈白色或淡绿色等。愈伤组织在长期的培养中能够形成分生组织区、管胞和色素细胞，或者形成体细胞胚。这种能够形成体细胞胚的愈伤组织称为胚性愈伤组织(embryonic cal-lus)。在野生稻组织培养实验中，发现从短花药野生稻的幼穗和茎节均能诱导出质地致密的呈淡黄色的胚性愈伤组织(图3-1)。宽叶野生稻的幼穗愈伤组织呈疏松的白色。在禾本科植物组织培养中，经常可以见到形成紧密的、不透明的、白色到淡黄色的胚性愈伤组织，这种愈伤组织表面光滑光亮、呈球状，不久由球状变为杯状结构。常常需要把培养基中的胚性愈伤组织分离出来进行单独继代培养。 在离体培养的中华猕猴桃茎段中所产生的愈伤组织通常为致密的瘤状，并呈淡绿色或绿色，生长缓慢。在2,4-D的作用下，愈伤组织则变为黄白色，脆弱易于分散。但若诱导条件不同，愈伤组织的形态和物理性质也有一定的变化。在柑橘子叶培养中，在MS附加lmg/LNAA和0.2mg/L 6-BA培养基上形成的愈伤组织紧密坚实呈瘤状，而在MS附加0.2mg/L 2,4-D和0.2mg/L 6-BA培养基上形成的愈伤组织则疏松易脆。质地不同的愈伤组织，有时可以相互转变，有时则是不可逆的。这种互变可以发生在愈伤组织生长的过程中，可能和消耗了培养基中的养料有关；也可以通过改变激素浓度的方法来诱导。培养基中加入高浓度的生长物质，可使坚实的愈伤组织变为松脆；反之，减少或除去生长物质，则松脆愈伤组织可转变为坚实的愈伤组织。 然而，具有相似的细胞团块的愈伤组织也常常包含着形态和机能各不相同的细胞群。在固体培养时，通常处于最表层部位的细胞与处于最下层而靠近培养基的细胞，其生长环境有着明显差异，而且其代谢活动和生长形式也不同。在不与琼脂培养基接触的表面，细胞的蛋白质合成能力较强，富含细胞质，膜系统发达，其外缘区迅速增殖形成近表面瘤状物的生长。而与培养基接触的一面细胞极少发生增生，细胞中蛋白质的合成能力较弱，液泡巨大，生长缓慢，仅仅是细胞分化形成紧密的组织块。 |
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