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 慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染是严重威胁人类健康的公共卫生问题，每年在全球引起的死亡人数高达65万。慢性HBV感染的功能性治愈指乙肝表面抗原消失（HBsAg），HBV DNA低于检测下限，是慢性HBV感染理想的治疗终点。目前仅有不足10%的患者接受抗病毒治疗后能实现功能性治愈，绝大多数患者需要长期甚至终身服药。因此，亟待开发新的治疗手段以提高慢性HBV感染的治愈率。 HBV共价闭合环状DNA（cccDNA)是病毒复制的模板，同时可表达所有的病毒蛋白。HBV cccDNA在细胞核内以微染色体形式存在，无法被当前的抗乙肝病毒药物清除，是慢性HBV感染难以治愈的主要原因。HBsAg是病毒的外膜蛋白，有大蛋白（L-HBs）、中蛋白（M-HBs）和主蛋白（S-HBs）三种，由S基因编码。cccDNA转录出的mRNA中，2.4kb mRNA翻译产生L-HBs，2.1kb mRNA翻译产生M-HBs和S-HBs。除cccDNA外，宿主基因组整合的HBV DNA是HBsAg的另一重要来源。为有效地抑制HBsAg的合成，HBV cccDNA和整合的HBV S基因均应作为乙肝治疗的靶点。 成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白9（Cas9）是一种强大的基因编辑技术，可以用于高效地敲除目的基因。一些体外和体内研究将CRISPR/Cas9技术应用于HIV、HBV及人乳头瘤病毒等疾病的治疗，实现了很高的病毒基因敲除效率。尽管如此，Cas9蛋白进行基因编辑所依赖的DNA双链断裂机制会在靶位点附近形成许多的大片段缺失。由于慢性HBV感染者宿主染色体往往存在HBV DNA的整合，CRISPR/Cas9在清除HBV cccDNA 的同时可能会影响宿主染色体的稳定性，从而限制了其在HBV治疗领域的临床应用。 CRISPR单碱基编辑器是2016年由David R.Liu等发明的一种新型基因编辑工具，可对基因组中的单个碱基进行精准修改，过程中不引起DNA双链断裂。现有的碱基编辑器有两类：胞嘧啶碱基编辑器（CBE）和腺嘌呤碱基编辑器。CBE可将靶位点的C：G碱基对永久地修改为T：A碱基对。基于这种特性，CBE被用于在基因中产生提前终止密码子，从而敲除基因。CBE用于敲除肝细胞中整合的HBV基因的可行性及其效率尚不清楚。近期，吉林大学第一医院周豪博士在明尼苏达大学医学院宋贵生教授和吉林大学第一医院牛俊奇教授指导下开展了一项研究探索了CBE沉默宿主基因组整合的HBV S基因的效率及其对HBs mRNA和HBsAg水平的影响。该研究于2022年3月26日在Hepatol Commun发表。 研究者首先设计了一个靶向HBV S基因保守区域的单链向导RNA（sgRNA） gRNA_S。gRNA_S位于HBV S基因的第239-258 位碱基，可引导CBE将编码HBsAg第30位谷氨酰胺的密码子CAG修改为终止密码子TAG。序列分析表明B、C、F、G和H基因型的HBV序列中有95%、93%、93%、9%和72%的序列可与gRNA_S特异性结合（图1）。接下来，研究者利用整合有HBV S基因的PLC/PRF/5细胞建立了表达CBE的稳定细胞系PLC/PRF/5-CBE，在该稳定细胞系中转导了表达gRNA_S的慢病毒载体及对照载体。最后提取细胞的DNA、RNA、上清及细胞裂解液进行分析以评估碱基编辑对HBV S基因的沉默效率。
图1 可在HBV S基因中产生提前终止密码子的sgRNA的设计 对碱基编辑后的细胞进行测序的结果表明，gRNA_S治疗组的细胞中有71%的细胞在S基因靶位点产生了提前终止密码子TAG，而对照组S基因靶位点的DNA序列没有任何变化（图2）。研究者利用northern blot检测了HBV mRNA水平的变化，结果发现gRNA_S治疗可以显著降低HBV 2.4和2.1kb RNA的水平，其中2.1kb RNA下降的幅度更大（图3）。同样，gRNA_S治疗组细胞培养上清中HBsAg的水平相比对照组降低了90%以上，提示单碱基编辑可有效地抑制HBsAg的合成。
图2 CBE介导的单碱基编辑可沉默HBV S基因
图3 CBE介导的单碱基编辑可显著降低HBs mRNA和分泌的HBsAg的水平 研究者利用western blot、免疫荧光及ELISA的方法检测了胞内HBsAg水平的变化，结果同样发现gRNA_S治疗组胞内HBsAg水平、HBsAg阳性的肝细胞数目均显著下降（图4）。为进一步提高S基因的沉默效率，作者构建了一个同时靶向S基因两个位点的双sgRNA系统。然而，在本研究中双sgRNA系统未能在S基因中产生更多提前终止密码子，这一结果可能是由于靶向S基因的两个sgRNAs过于接近所致。最后，研究者对gRNA_S多个可能的脱靶位点进行了测序，未检测到脱靶效应。
图4 靶向HBV S基因的单碱基编辑可有效降低胞内HBsAg水平 本文第一作者为吉林大学第一医院肝胆胰内科周豪博士生。明尼苏达大学医学院宋贵生教授和吉林大学第一医院肝胆胰内科牛俊奇教授为共同通讯作者。 文献来源：Zhou H, Wang X, Steer CJ, Song G, Niu J. Efficient silencing of hepatitis B virus S gene through CRISPR-mediated base editing. Hepatol Commun. 2022 Mar 26. doi: 10.1002/hep4.1933. Epub ahead of print. PMID: 35338607.  |
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