发文章
发文工具
撰写
网文摘手
文档
视频
思维导图
随笔
相册
原创同步助手
其他工具
图片转文字
文件清理
AI助手
留言交流
材料
RPMI-5 或DMEM-5 完全培养基
新鲜分离的小鼠器官: ≤6 周龄的小鼠胸腺;6 周至6 个月龄的小鼠脾脏和淋巴结
60mmX15mm 培养皿
剪刀和镊子(保存在70 %乙醇的烧杯中)
装有19G 针头的6ml 注射器
200μm 尼龙滤网
步骤
将新鲜分离的器官放入盛有3ml RPMT-5 或DMEM-5 完全培养基的60mmX15mm培养皿(每种器官一个培养皿)中, 用剪刀将器官剪碎。
用6ml 注射器的活塞将组织块向培养皿底面用力挤压直到仅剩纤维组织。
用装有19G 针头的6ml 注射器将组织悬液反复抽吸数次,以进一步粉碎组织团块。
将细胞悬液通过200μm 尼龙滤网滤入离心管中。用约4ml 完全培养基洗一次培养皿,如需要则重复一次,之后将洗液通过滤网加入离心管中。
在离心机中以1000r/min (200g) 离心10min 后弃上清 。用20ml 完全培养基将沉淀重悬后离心,再以适量培养基重悬以便计数 。
如细胞不能立即处理,最好的保持细胞活力的办法是将细胞悬液置于冰块中。这种处理也能减少因细胞贴壁引起的细胞损失 。
脾脏细胞悬液在进行淋巴细胞计数之前最好先去除红细胞(RBC) 。胸腺和淋巴细胞悬液则不必去除红细胞。脾脏细胞的亚群分离也需先去除红细胞。
附加材料
ACK 裂解缓冲液
每个脾脏用约5ml 裂解缓冲液悬浮脾脏细胞;一个12ml 试管可用于裂解一个或两个脾脏,也可以用50ml 离心管裂解更多的脾脏。
室溫孵育5min ,间以摇动。
加入洗液直至装满容器,在低速离心机上以200g 离心10min 后弃上清。再洗沉淀一次并以适量培养基重悬以便下一步操作(如去除死细胞、细胞计数或者细胞分离)。
下面介绍的方法,其基本原理是基于活细胞(密度较小)和死细胞(密度较大)密度不同,从而有助于将活的淋巴细胞与红细胞分离。
高密度溶液:Ficoll-Paque (Ficoll 和泛影酸钠;Pharmacia LKB) 或Lympholyte-M(Cedarlane)12ml 或50ml 聚丙烯离心管(比聚苯乙烯离心管好)
注: Ficoll-Paque 和Lympholyte-M 的密度与温度有关;该方法中所采用的以及其他商品化的高密度溶液适合在室温中使用。因此应注意使细胞悬液、离心和高密度溶液控制在室温。否则会因活细胞沉入离心管底导致在密度界面上损失活细胞。
用RPMI-5 完全培养基混悬细胞, 分装到离心管中使其细胞数达到 0. 5X108~ 1 X108个细胞/2ml (12ml 离心管)或 1X 108~ 5 X 108 个细胞/5 ml (50ml 离心管)。
用移液器吸取3ml (使用12ml 离心管时)或5ml (使用50ml 离心管时)高密度溶液, 将枪头伸到离心管底,缓慢将高密度溶液加入细胞悬液下方。
室温, 800g 离心15min。为了取得好的分离效果,最好将离心机的”brake” 开关关掉。
使用5ml 移液器,沿高密度层表面缓慢移动移液器枪头, 吸入漂浮在高密度层上方的活细胞, 尽量少收集高密度溶液。将活细胞移入另一管中。
加入RPMI-5 完全培养基(少量细胞加入10ml , 细胞量较多时加入40ml) ,室温,200g 离心10min。重复一次。
以适量培养基混悬细胞以便进行下一步操作。
来自: 塔奇曼 > 《实验动物学》
0条评论
发表
请遵守用户 评论公约
一力降十会:如何制备流式样本
因为这类样本太好获得了,比如脾脏的样本,一个脾脏内往往至少就有10e8的细胞数,如果我们不对细胞进行计数而直接取了单细胞悬液就去染...
手把手教你开展免疫细胞与肿瘤细胞共培养实验
由于脾脏是机体最大的免疫器官,含有大量的淋巴细胞和巨噬细胞,是机体细胞免疫和体液免疫的中心,因此本文将以脾细胞为例,详细介绍如...
Cas9蛋白过表达慢病毒包装构建步骤
Cas9蛋白过表达慢病毒包装构建步骤。1、Cas9蛋白的基因长4kb,Cas9表达慢病毒的包装效率和感染力比一般慢病毒低,推荐经过浓缩纯化再用于感染目的细胞。2、Cas9基因较大,包装时产生的空壳病毒(即有病...
手把手教学——THP-1细胞的培养方法和注意事项
手把手教学——THP-1细胞的培养方法和注意事项。(3)通过传递箱将细胞拿进细胞房,打开照明,打开细胞台子的玻璃门,用酒精喷洒手和细...
悬浮细胞换液
细胞培养流程及注意事项
细胞培养流程及注意事项。加入对应细胞的完全培养基,重悬细胞,再以5x105个/ml细胞接种至培养瓶/培养皿中。加入冻存液:加入细胞冻存液...
AAV的包装纯化浓缩方法总结
AAV的包装纯化浓缩方法总结。60%碘克沙醇(ml)4)将超滤管中剩下的液体反复吹打后吸至病毒储存管中,将一定体积的PBS+0.001%PF68加入至浓缩管中,反复吸打混匀后将液体吸出,一般情况下AAV浓缩离心完成后...
分子生物学专题——慢病毒生产及使用(一)
3、细胞计数,将细胞全部晃下,加入 3mL 37 ℃ 预热的 10% DMEM,用 10mL 移液管进行吹打,较大力吹打 6~8 次即可,不留死角,之后,将所有细胞吸出,置于15mL 离心管中,取 50ul 混匀后的细胞于 1.5...
想做蛋白质组学,不知道该怎么收集样本?
想做蛋白质组学,不知道该怎么收集样本?样本质量是实验中影响实验结果的最关键因素,因此用于研究的样本,在采集、制备、贮存、运输过程中应尽可能地做到迅速,最大限度的缩短从样本采集到实验的时间...
微信扫码,在手机上查看选中内容