医学美图：P53免疫染色·Ki67概述

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【P53与Ki67免疫染色】

  p53基因及p53基因异常 

人p53基因位于第17号染色体短臂上，是一种由分子量为53,000,393个氨基酸组成的蛋白质，是一种对维持生命具有极其重要功能的基因，包括:①激活修复受损DNA的蛋白质；②诱导难以修复DNA的细胞凋亡；③参与细胞周期控制等。

遗传基因产物p53，在1979年，被SV40（simian virus 40:肉瘤病毒的一种）鉴定为与被 transform（转化）的细胞中表达的大型T抗原结合的蛋白质。在SV40转化的细胞中发现了正常细胞的100倍以上的p53量，p53的进一步变异会增强转化能力，因此当初，p53被设想为癌遗传基因。但是，之后不久，确认了正常细胞的 p53中没有癌促进能力等，再加上视网膜母细胞瘤的研究等同时期提高的癌抑制遗传基因的存在性，从别的角度的p53研究变得活跃起来，判明了当初被鉴定的 p53，实际上是几个密码子变异的变异型p53。也就是说，只有在另一个染色体上的正常型（野性型）p53缺失或变异的情况下，才会促进癌变，此后，p53作为代表性的 “抑癌基因” 被广泛认识。

▼【p53突变的性质】

▲在人的肿瘤中发现的变异型p53等位基因的大多数可以说是一定会带来氨基酸置换的点突变。其他的偏离、缺失/插入、静默等变异频率低。p53的突变的大部分被认为会对p53蛋白的结合结构域产生影响。

p53遗传基因在许多肿瘤中以极高的比率被检测出其变异，其多种功能被阐明，被称为基因组的门卫（gate keeper）或守护者（guardian）。p53蛋白质虽然具有多种功能，但其主要功能是转录活性化能力。p53蛋白质形成四聚体，与目标遗传基因的启动子中存在的被称为p53 RE（p53 responsive element）的特异DNA排列结合，显示转录活性。

目前已鉴定出许多靶基因，其中许多与细胞周期调节（p21，细胞周期蛋白G，14―33―s），细胞凋亡诱导（p53 AIP1，BAX，FAS，DR2），DNA修复（GADD45，p53 R2）有关。

众所周知，肿瘤中发生的p53遗传基因的变异大多会引起p53蛋白质的DNA结合领域的构造变化，不仅会使其丧失作为转录因子的功能（loss of function），还会与野生型的p53蛋白质结合，阻碍其DNA结合能力（dominant negative 效应）。

  p53基因的免疫组织学分析 

正常的p53蛋白在向核转移后，通过MDM―2（multiple murin double minute 2）的结合被诱导的ubiquitin―proteasome机制迅速分解，因此半衰期短（5～45min），在免疫组织学上没有发现p53蛋白的核内聚集。

p53的异常大多是错义变异，变异部分集中在核心结构域中的4处保存领域。核心结构域也被称为DNA结合结构域，p53蛋白作为转录因子，是与靶基因的p53 RE结合的重要部分。因此，由于核心结构域的变异，p53蛋白与p53 RE的结合被阻碍，引起转录活性能的降低。进而，引起靶基因表达水平的降低。p53靶基因之一的MDM―2也因p53的变异而降低表达水平，因此p53的分解时间显著延长，引起核内集聚。

  用于p53蛋白免疫染色的抗体 

检测抑癌基因p53异常的方法有免疫染色、PCR―SSCP（polymerase chain reactionsingle strand conformation polymorphism）法、直接序列（direct sequence）法等。其中，通过免疫染色检测异常最简便，在成本方面也优于其他方法，通常经常被使用。

在免疫染色的阳性所见中，有稀稀拉拉的阳性细胞的情况（spotty），巢状有1到2个腺管呈阳性的情况（focal），有必要将其与具有区域性的弥漫性呈阳性的情况（diffuse，positive）分开分类。前2者不一定与PCR―SSCP和直接顺序法的结果相关的情况很多。

抗p53抗体染色在病理学研究·日常性病理组织诊断时也是有用的，但是，由于使用抗体种类的不同，阳性表达模式和阳性频率也不同，炎症等微小环境的变化引起野性型p53蓄积量的增加（分解延迟），即使是非肿瘤性细胞（包括正常细胞）也能呈现阳性像等，从某种意义上来说，必须很好地认识到这一必然性的弱点。换言之，如果不是在认真斟酌从HE染色等基本的病理染色标本中发现的组织形态像的基础上，就无法正确评价同领域中的抗p53抗体染色像，同时也应该铭记，无论如何也无法得出是否存在p53异常的结论。

  p53基因异常与分子病理学 

具体来说，在Barrett上皮的癌前病变的诊断，食道癌的早期诊断，胃癌和FAP（familial adenomatous polyposis），Lynch症候群以及Li―Fraumeni症候群，胃癌家系的germline mutations，NEC（neuroendocrine carcinoma）和MANEC（mixed adenoneuroendocrine carcinoma）的诊断，恶性淋巴瘤的恶性度诊断等中作为molecular diagnosis被使用。

▲P53及KI67在食管正常黏膜及EP癌中的不同表达。

▲P53在分化型胃癌中的阳性表达。

在大肠中也同样被用在肿瘤的早期诊断上。在大肠腺瘤中，随着从低异型度到高异型度，p53蛋白的表达阳性率变高。在腺瘤、M癌、SM癌中不同形态的p53蛋白表达的比较中，与腺瘤相比，在M癌、SM癌中表达明显。

  p53免疫染色的局限性