质粒构建流程.doc

质粒构建流程一、引物设计1）取得目的基因序列，可选用数据库NCBI2）软件分析目的基因可用酶切位点。使用PRIMER5分析出序列不包含的酶切位点，即为可用没切位点。3）选择载体。根据转染细胞和实验室资源，选择合适载体。如PCDNA31，4）选择酶切位点。对照目的基因可用酶切位点和载体上的酶切位点，选择二者共有的作为备选。载体上两个酶切位点的距离应有几十BP以上，选实验室常用酶切位点。5）使用PRIMER5设计目的基因引物，目的产物应包含从启动子到终止子全部碱基。6）根据选择的酶切位点，查找对应的酶切位点保护碱基，将对应片段添加到设计的引物两端，注意酶切位点的前后顺序。一般选择三个保护碱基。7）引物设计完成，送公司合成。二、目的片段获取1RNA提取试剂盒BIOTEKE高纯总RNA快速提取试剂盒离心柱型（裂解液RL4℃、漂洗液RW20℃保存）准备冰盒、4℃预冷离心机、EP管2套、吸附柱RA一套操作步骤1）将1000ΜL裂解液RL加入细胞中，混合5MIN。2）加200ΜL氯仿混合，震荡15S，室温孵育3MIN。3）4℃，12000RPM离心10MIN。4）最上层水相转移至新EP管中（体积约550ΜL）5）加入1倍体积（550ΜL）70乙醇，混匀6）全部转移到套收集管的吸附柱RA中，4℃，10000RPM离心45S7）弃废液，重套收集管，加500ΜL去蛋白液RE，12000RPM离心45S8）弃废液，重套收集管，加700ΜL去漂洗液RW，12000RPM离心60S9）弃废液，重套收集管，加500ΜL去漂洗液RW，12000RPM离心60S10）弃废液，重套收集管，12000RPM空离2MIN11）吸附柱放入新EP管，加50ΜLRNASEFREEWATER于膜上，室温放置2MIN12）4℃，12000RPM离心60S13）点样5ΜLRNA1ΜL10BUFFER，15琼脂糖凝胶电泳，100V，3MIN，可见3条亮带。14）20℃保存2RNA反转录试剂盒TAKARAPRIMESCRIPTRTREAGENTKITWITHGDNAERASER（20℃保存）准备冰盒，②④⑤⑥取出解冻，①③为酶不可取出，预冷离心管操作步骤1）基因组DNA去除（10ΜL体系）②5GDNAERASERBUFFER2ΜL①GDNAERASER1ΜLTOTALRNA4ΜL可根据RNA浓度调整⑥RNASEFREEWATER3ΜLPCR仪中进行，程序42℃，2MIN→4℃注RNA的量可根据浓度调整，混合液冰上配制，酶最后加入2）反转录反应（20ΜL体系）④5PRIMERSCRIPTBUFFER24ΜL③PRIMERSCRIPTRTENZYMEMIXI1ΜL⑤RTPRIMERMIX1ΜL⑥RNASEFREEWATER4ΜL1）反应液10ΜLPCR仪37℃，15MIN→85℃，5S→4℃注可直接将第2步反混合液好后加入到第1步反应液中3）15MLEP管收集，20℃长期保存3PCR扩增高保真酶PRIMERSTAR扩增，50ΜL体系如下5PSBUFFER10ΜLDNTP4ΜLDH2O325ΜLPRIMERSTAR05ΜLCDNA1ΜL可变RPRIMER1ΜLFPRIMER1ΜL点样5ΜLPCR产物1ΜL6BUFFER，15琼脂糖凝胶电泳，100V，15MIN4PCR产物纯化1）液相纯化（产物电泳结果只含目的条带）试剂盒MICROELUTECYCLEPURESPINPROTOCOLOMEGABIOTEKD629301①将PCR产物加入15MLEP管，加入5倍体积BUFFERCP，混匀。②转移至HIBINDMICROELUTIONDNA柱（套收集管），室温离心10000G，1MIN。③弃废液，加700ΜLDNAWASHBUFFER（含乙醇）到柱子，室温离心10000G，1MIN。④弃废液，重复③⑤弃废液，空管离心13000G，1MIN⑥柱子放入新EP管，加1020ΜLELUTIONBUFFER到膜上，室温孵育35MIN，离心10000G，1MIN⑦电泳检测2）割胶回收（产物电泳结果含杂带）①将含目的条带的琼脂糖凝胶切下（切得尽量小），放入15MLEP管。②加等体积（1G1ML）BINDINGBUFFER（XP2）,60℃金属浴7MIN左右至胶溶解（溶液为淡黄色），混匀2MIN③溶液加入离心柱，离心10000G，1MIN，废液倒回再离一次④弃废液，加300ΜLBINDINGBUFFER（XP2），离心10000G，1MIN⑤弃废液，加700ΜLSPWWASHINGBUFFER，离心10000G，1MIN⑥重复⑤⑦空管离心13000G，2MIN，弃废液，柱子转移到新EP管PCR程序95℃5MIN95℃30S56℃30S35CYCLE72℃1MIN72℃10MIN注可根据不同基因调节退货温度，延伸时间，循环数。⑧加入3050ΜLELUTIONBUFFER于膜上，室温孵育1MIN，离心13000G，1MIN⑨电泳检测3、双酶切30ΜL反应体系如下PCR纯化产物15ΜL10M/L/KBUFFER3ΜL3DH2O10ΜL酶A1ΜL酶B1ΜL反应条件TAKARA酶30℃水浴1H→65℃金属浴10MIN终止反应注BUFFER类别依使用的酶具体选择，见附表4、连接1）双酶切后，可将质粒酶切产物琼脂糖电泳12ΜL2）酶切产物液相纯化3）20ΜL连接体系（皆可）PCR产物5ΜLPCDNA312ΜL10T4BUFFER2ΜLT4LIGASE1ΜL3DH2O10ΜLPCR仪中进行22℃，30MIN→4℃冰箱过夜注连接产物20℃可长期保存5、转化准备碎冰，灭菌EP管、LB空液体培养基，带抗性培养板，超净工作台，移液枪，水浴锅加热42℃1）将感受态细胞置于冰上，待其融化2）超净工作台中，将连接产物10ΜL加入100ΜL感受态细胞，或质粒13ΜL加入100ΜL感受态细胞3）轻混匀，冰浴30MIN4）热击水浴42℃，45S，冰浴1MIN5）加900ΜLLB空培养基，摇菌150RPM，37℃，1H6）浓缩离心13000RPM，1MIN，上清液留约200ΜL重悬菌体，部分涂板（50100ΜL）7）完全吸收后，37℃倒置培养1216H6、菌落PCR1）以RTAQ酶50ΜL体系配制PCR反应液，每个PCR管分装15ΜL，体系如下3DH2O357ΜL10BUFFER5ΜLMGCL23ΜLDNTP4ΜLRTAQ03ΜLVECTOR12ΜL10M/L/KBUFFER3ΜL3DH2O13ΜL酶A1ΜL酶B1ΜLPCR产物63ΜLPCDNA3107ΜL10T4BUFFER2ΜLT4LIGASE1ΜL3DH2O10ΜLPCR程序95℃5MIN95℃30S56℃30S35CYCLE72℃1MIN72℃10MIN注程序与DNA扩增一样RPRIMER1ΜLFPRIMER1ΜL2）灭菌牙签挑单菌落放入PCR体系中搅一下，再在新板划板（注意编号），每板挑10个菌。新划的板37℃倒置培养1216H。3）琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，记录含目的条带的菌落号备用。7、测序1摇菌1）PCR检测有目的条带的菌落，挑选23个较好的以供摇菌2）三角瓶中分装10MLLB抗性液体培养基3）用10ΜL枪头挑起选择的菌落打到培养基中