【原】如何构建质粒？

一、引物设计

1.选择合适的载体。酶切位点及其顺序（酶切位点的顺序一定不能颠倒）。

2.在NCBI上再次确认目的片段的碱基序列。

①. 使用word排除目的片段里含有的酶切位点，最后确定所使用的酶。

②. 设计引物：

primer-up：保护碱基4个,上游酶切位点,首位20个碱基;

Primer-down：保护碱基4个,下游酶切位点,末尾20个碱基的反向互补碱基;

③. 核对----送去合成。

④. 对合成的引物离心，10000rpm、5-10min、 4℃，在超净台按照管子上标注的体积加入高压水（2dH2O），再把上游引物和下游引物混在一起， 4℃保存。

二、 PCR（P出目的片段）

（一）、从菌液里P出目的片段：

1，揺菌过夜。

15ml离心管：2ul实验室菌液，Xul相应的抗生素，3ml LB

2,pcr。

Pcr(50ul)反应体系：菌液1ul，2x PFU mix 25ul ，Primer 1ul；2d H2O 23ul。

Pcr温度体系：94℃ 30sec，94℃ 30sec 33cycles， 58℃ 30sec 33cycles，72℃ X min；72℃ 5min。

（X是根据片段的长度设定，500-1000bp/min，退火温度根据Tm值来计算，一般低于Tm值2℃）

3，跑胶、回收。

（1），配胶：

1%的琼脂糖胶大块：称0.6g的琼脂糖，加入60ml的1X TAE，加入0.6ul的EB(待温度降到50-60℃左右时)煮沸3次；25分钟后，即可点样跑胶。

（2），跑胶：130-150V、25-30分钟左右。

（3），紫外灯下观察，切胶（要带防护手套和口罩）

4，做胶回收（天根{TIANGEN}公司的DNA纯化回收试剂盒）:

按照试剂盒的protocol来做，在胶回收的最后一步，Elution Buffer预先在55-65℃温箱中水浴，并且在加过EB后，放在37℃温箱中2min。

对胶回收的产物跑胶验证。可建立10ul的体系：回收产物2ul、10xloading buffer 2ul、2d H2O 6ul。

三、 酶切、链接

1，目的片段酶切：（37℃酶切过夜或者4小时）

50ul的体系 ：insert ：上述胶回收产物 35ul， 10 x H buffer（1.5x） 7ul， dd H2O 6ul，酶1 1ul，酶2 1ul；

2，载体酶切：（37℃酶切过夜或者4小时）

20ul的体系 ：Vector （1ug/ul）：2 ul，10 x buffer（1.5x） 3ul，dd H2O 13ul， 酶1 1ul，酶2 1ul

为方便以后使用，载体可以一次性多切点。

3， 酶切时，首先要核对一下酶的buffer，有时双酶切时两个酶不能共用一种buffer，那么就要先切一端，酶切回收后再用另一酶切另一端，然后再酶切产物回收。

4，连接：

12ul的体系：2x Rapid Ligation 6ul， Vector 0.8ul，insert 4.5ul，T4 DNA Lignase 1ul

四、 转化

感受态细菌10ul；质粒 10ul

⑴、冰上20分钟-→热激：42℃、90秒-→冰上2min

⑵、加1ml SOC（或者1ml LB），37℃、180 rpm、45min。

⑶、将上述转化后的菌液加入到100ml的LB中。再按抗生素：LB=1:1000的比例加入抗生素，（100ml的LB加50ul的2Kx的氨苄）。

⑷、250rpm、过夜。

五、 质粒大抽

六、 收菌

取过夜菌至50毫升离心管，离心：6000g、3-5分钟、4℃。再重复一次，每管共收集100毫升过夜菌沉淀。（倒置于草纸上使液体流尽)。

七、 重悬

每管加入8ml的RES-EF(RnaseA)，重悬细菌沉淀—充分Vortex或用枪头吹打沉淀。确保沉淀完全散开，无可见细菌团块。

裂解： 每管加入等量的LYS-EF bufffer，即8ml。轻轻上下颠倒离心管4-6次，（勿震！！）室温放置5min，使细菌完全裂解，溶液透明，无团块或絮状物。

注意：vortex或其它剧烈操作会导致基因组DNA断裂，易导致最终所得质粒被基因组DNA污染

平衡：

⑴：滤芯插入柱子，将柱子驾于50ml离心管上（或者直接架于50ml离心管架上）

⑵：取15ml EQU-EF buffer 沿滤芯四周加入—充分平衡滤芯。

注意：①离心管内的液体不要浸没滤柱的头，所以要勤于倒弃滤液，②在过滤平衡液的同时，进行5、6步，防止滤芯干掉。

中和：在等待EQU-EF buffer滤完时，往裂解好的菌液中加入8ml NEU-EF buffer，颠倒混匀，冰上孵育5min。（不能vortex）

离心、过滤：

⑴：离心中和过的菌液：10000rpm、5-10min、at 4℃--质粒存在于上清中。

（离心使沉淀更加紧密，更集中于管底，对于进一步提高质粒质量会有所帮助）

⑵：将上清吸入到平衡好的滤芯中,重力自流尽。

洗一：过滤完毕后，吸取5ml的FIL-EF buffer，沿滤芯四周加入（将粘在滤芯上的质粒洗下来）--过滤完后，将滤芯弃掉。

洗二：往滤柱中加入35ml的ENDO-EF buffer—去内毒素

洗三：待滤完后再加入15ml的wash-EF buffer—过滤。

洗脱：取一支干净的15ml超速离心管，将滤完的柱子插入到离心管中，用高压条将二者绑好，往滤柱中加入5ml Elu-EF buffer.

(Elu-EF buffer预先放在50℃的恒温箱中加热，可提高洗脱效率)

沉淀：待Elu-EF buffer滤完后，弃滤柱，往离心管中加入5ml的异丙醇（将质粒沉淀下来），混匀（充分vortex），静止10min---10000rpm、30min、4℃---弃上清。

洗涤：加5ml的70％酒精（ETOH）或用15ml三蒸水（高压过）+35ml的无水乙醇配制（在超净台进行），混匀（上下颠倒即可），离心：10000rpm、10min、常温。

弃上清，重复上述步骤一次（再洗涤一次）弃上清---到超净台用200ul枪头把上清尽量洗净----再空离一次，在超净台用小枪头把液体洗净---吹干。

溶解：取100-300ul高压过的H2O-EF溶解质粒--定量后，将质粒的浓度调至1ug/ul—最后，保存到-20℃。