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此次为大家双手奉上质粒提取的知识，各位接好了呦~ 质粒，是啥？ 质粒是能够自主复制的小型环状DNA分子，多存在于细菌及酵母菌等生物中，是基因工程中最常用的运载体，担负着将目的基因转移到宿主细胞中的重要使命。 基因表达载体的构建（也就是目的基因与运载体结合）是基因工程的核心步骤，用作运载体的质粒更是掌上明珠。我们需要从细菌中分离出质粒以备后用。 如果分离不好的嘛...... 提取出的目的基因就只能眼巴巴地望着彼岸的受体细胞吹凉风≈  质粒 知道厉害了吧 如何提取质粒呢？ 视频献上，头脑风暴一下 热身之后，看一看质粒提取的具体操作。 分离质粒的方法有很多，但都离不开三个主要步骤。 即培养细菌使质粒扩增 1.将鉴定测序正确的克隆菌液涂在LB固体平板（一种培养基，使质粒扩增）。 2.置于37℃恒温培养箱，培养12-17h，待长出菌落。 3.灭菌15ml离心管内加入5ml含抗生素的LB液体培养基，编号标记。 4. 挑取单克隆菌团放置液体培养基，每个培养基放置1个菌落。 5. 37℃，180rpm，振荡培养过夜。 现在，一团团质粒丰富细菌准备就绪任人宰割啦。  1.离心扩增好的菌液，按说明书将菌液重悬，转入1.5ml离心管中。 2.用质粒小量抽提试剂盒，按说明书要求提取质粒。  3.细菌高速离心1min,彻底去除上清。 4.加入250ulRB溶液，振荡器充分悬浮细菌。 5.加入250ulLB溶液。立即上下颠倒10次，使细菌裂解，室温，放置2min。 6.加入250ulNB溶液。立即上下颠倒10次，使之充分中和，室温，放置2min。 7.室温，1500rpm，高速离心15min。 甩啊甩、震啊震 颠啊颠、摇啊摇 摇到外婆桥~ 8、将吸附柱放入收集管内，离心得到的上清转移至吸附柱，室温，15000rpm，高速离心30s。 了解一下吸附柱↓ ↖视频中用到的吸附柱 9、弃废液，将吸附柱放入收集管，加入700ul WB溶液到吸附柱中，15000rpm，高速离心30s。 10、重复上一操作。 11、将吸附柱放入干净的1.5ml 离心管中，加30-50ul预热的Elution Buffer，室温，放置2min，高速离心1min。 12、样品进行电泳检测：1%琼脂糖凝胶电泳，上样量为2ul，紫外灯下观察，最明亮的带为超螺旋形式，可以在一定程度上表明提取质粒的纯度。  1. 将之前提取好的质粒放入1.5ml离心管中，加入1/10体积的3mol/L 无菌乙酸钠溶液。 2. 加入2倍体积的无水乙醇，放置于-20℃沉淀4-6h或过夜。 3. 4℃，高速离心机14000rpm，离心20min. 4. 弃去上清，70%乙醇洗2次。 洗洗更健康 5. 空气干燥，可置超净工作台干燥。 6. 加200ul无菌水溶液干燥后所得沉淀，即为质粒溶液。 7. 紫外分光光度计测量质粒浓度和产量。 质粒提取只是系列实验准备中的一步，为伟大的基因工程奠基 ◆◇◆◇
来源：“生命青年传媒中心”公众号 |
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