【原】质粒DNA提取实验步骤及方法

实验步骤

1.摇菌培养

1）将鉴定测序正确的克隆菌液涂在LB固体平板。

2）置于37℃恒温培养箱，培养12-17h，待长出菌落。

3） 灭菌15ml离心管内加入5ml含抗生素的LB液体培养基，编号标记。

4） 挑取单克隆菌团放置液体培养基，每个培养基放置1个菌落。

5） 37℃，180rpm，振荡培养过夜。

2.收获细菌并裂解

1） 离心扩增好的菌液，按说明书将菌液重悬，转入1.5ml离心管中。

2）用质粒小量抽提试剂盒，按说明书要求提取质粒。

3） 细菌高速离心1min,彻底去除上清。

4）加入250ulRB溶液，振荡器充分悬浮细菌。

5）加入250ulLB溶液。立即上下颠倒10次，使细菌裂解，室温，放置2min。

6）加入250ulNB溶液。立即上下颠倒10次，使之充分中和，室温，放置2min。

7）室温，1500rpm，高速离心15min。

8）将吸附柱放入收集管内，离心得到的上清转移至吸附柱，室温，15000rpm，高速离心30s。

9）弃废液，将吸附柱放入收集管，加入700ul WB溶液到吸附柱中，15000rpm，高速离心30s。

10）重复上一操作。

11）将吸附柱放入干净的1.5ml 离心管中，加30-50ul预热的Elution Buffer，室温，放置2min，高速离心1min。

12）样品进行电泳检测：1%琼脂糖凝胶电泳，上样量为2ul，紫外灯下观察，最明亮的带为超螺旋形式，可以在一定程度上表明提取质粒的纯度。

3.质粒的纯化

1）将之前提取好的质粒放入1.5ml离心管中，加入1/10体积的3mol/L 无菌乙酸钠溶液。

2）加入2倍体积的无水乙醇，放置于-20℃沉淀4-6h或过夜。

3）4℃，高速离心机14000rpm，离心20min.

4）弃去上清，70%乙醇洗2次。

5）空气干燥，可置超净工作台干燥。

6）加200ul无菌水溶液干燥后所得沉淀，即为质粒溶液。

7）紫外分光光度计测量质粒浓度和产量。

测量OD260和OD280的值：质粒DNA浓度=OD260×50×稀释倍数（μg/mL）。