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大肠杆菌感受态细胞的制备 1）从大肠杆菌平板上挑取一个单菌落于 3mlLB 培养基的试管中，37℃振荡培养过夜 2）取 0.4ml 菌液转接到 40mlLB 液体培养基中，37℃振荡培养 2~3h。 3）菌液转移到 50ml 离心管中，冰上放置 10min 4）4℃离心 10min（4000r/min） 5）倒出培养液，将管口倒置以便培养液流尽 6）用冰浴的 0.1mol/L 氯化钙 10ml 悬浮细胞沉淀，立即冰浴 30min 7）4℃离心 10min（4000r/min） 8）倒出上清液，用冰浴的 0.1mol/L 氯化钙 2ml 悬浮细胞（冰上放置） 9）分装细胞，200ul 一份，4℃保存 质粒 DNA 的转化 1）取 200ul 新鲜制备的感受态细胞，加入质粒 DNA2ul 混匀，冰浴 30min 2）离心管放到 42℃保温 90s 3）冰浴 2min 4）每管加 800ulLB 液体培养基，37℃培养 1h（150r/min） 5）取适当体积（100ul）的复苏细胞，涂布在选择性培养基上，正置 30min 6）倒置平皿 37℃，12~16h，出现菌落 质粒提取步骤 1）取 1~4ml 在 LB 培养基中培养过夜的菌液，12000 转离心 1min，弃上清 2）加 250ul 溶液Ⅰ/RNaseA（溶液Ⅰ为细胞悬浮液）混合液，漩涡剧烈振荡直至菌体完全重新悬浮，室温静置 1-2min 3）加入 250ul 溶液Ⅱ（细胞裂解液），轻柔的反复颠倒混匀 5-6 次。室温放置 1-2min，使菌体充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液 4）加入 350ul 溶液Ⅲ（中和液），立刻轻柔地反复颠倒混匀 5-6 次，此时会出现白色絮状沉淀 5）12000 室温离心 10min，收集上清 6）将上清置于 DNA 纯化柱中，静置 1-2min 7）12000 转离心 1min，弃滤液 8）加入 500ul 溶液 PB（洗涤液）12000 转离心 1min，弃滤液，目的是将硅胶膜上吸附的蛋白、盐等杂质洗脱，以获得高质量质粒 DNA 9）加入 500ul 溶液 W（去盐液），12000 转离心 1min，弃滤液，重复一次 10）12000 转离心 3min，以彻底去除纯化柱中残留的液体 11）将 DNA 纯化柱置于新的离心管中，悬浮滴加 50-100ul 溶液 Eluent（为无菌的双蒸水，PH 为 8.0-8.5），室温放置 2min 12）12000 转离心 1min，此时管底即为高纯度的质粒 DNA，质粒于-20℃保存 质粒提取步骤：吸取液体培养基于 1.5ml 离心管中 12000 转离心 1min，弃上清，吸取培养基重复离心弃上清离心，留取少量菌液作为菌种保存，可直接置于-20℃——加250ulBufferS1 悬浮细菌，悬浮均匀——加 250ulBufferS2 温和充分的上下翻转 4-6 次混合均匀，使菌体裂解——加 350ulBufferS3 温和上下翻转 12000 离心 10min——取上清液转移到专用的制备管（2ml）12000 转离心 1min，弃滤液——加 500ulBufferW112000转离心 1min，弃滤液——加 500ulBufferW212000 转离心 1min，弃滤液，重复一遍——将制备管置回 2ml 离心管 12000 转离心 1min——将制备管移入新的 1.5ml 离心管中，加 60~80ulEluent 或离子水，室温 1min12000 转离心 1min——移去制备管，将有质粒的离心管于 4℃或是-20℃保存。 |
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