Abbexa 质粒 MiniPrep 试剂盒检测程序

Abbexa Plasmid MiniPrep Kit 提供了一种从≤20 ml (LB) 或 ≤4 ml 细菌细胞培养物中分离高质量质粒 DNA 的有效方法，DNA 产量高达 40 µg。独特配制的裂解缓冲液和中和缓冲液允许无差错视觉识别完整的细菌细胞裂解和中和。纯化的质粒 DNA 适用于多种分子生物学应用，包括限制性内切酶消化、连接、转化、DNA 测序和转染。

Abbexa 质粒 MiniPrep 试剂盒套件内容：

零件 50 次 200 次

重悬缓冲液 (RB) 15 毫升 60 毫升

裂解缓冲液 (LB) 15 毫升 60 毫升

中和缓冲液 (RB) 20 毫升 80 毫升

洗涤缓冲液 (WB) 10 毫升 2 × 20 毫升

洗脱缓冲液 (EB) 5毫升 10 毫升

核糖核酸酶 A (10 毫克/毫升) 150 微升 600 微升

带收集管的小型质粒离心柱 50 2×100

Abbexa 质粒 MiniPrep 试剂盒检测程序：

1、通过将整个 RNase 小瓶添加到重悬缓冲液瓶中来制备工作重悬缓冲液。充分混合并储存在 2-8 °C 之间。

2、通过向每个洗涤缓冲液瓶中加入 100% 乙醇来制备工作洗涤缓冲液：40 ml (50 rxns)；或 2 × 80 ml (200 rxns)。搅拌均匀。

3、将过夜培养的细菌悬浮液添加到微量离心管中。测量 LB 培养基体积并记下下表中所需的试剂体积。

LB培养基 工作重悬缓冲液  裂解缓冲液  中和缓冲液

≤ 5 毫升 250 微升 250 微升 350 微升

5-10毫升 500 微升 500 微升 700 微升

10-15 毫升  750 微升  750 微升  1050 微升

15-50 毫升  1000 微升  1000 微升  1400 微升

4、以 10,000 × g 离心 1 分钟。弃去上清液。

5、根据上表，将适量的工作重悬缓冲液（与 RNase A 预混合）添加到细胞沉淀中，并通过移液器将其完全重悬。

6、根据上表添加适量的裂解缓冲液（蓝色液体）。将试管倒置 4-6 次，立即彻底混合。裂解液应从不透明变为亮蓝色。

7、在完成第 6 步后的 5 分钟内，根据上表添加适量的中和缓冲液（黄色液体）。通过颠倒试管 4-6 次彻底混合。中和完成后，裂解液将变为黄色，并形成淡黄色沉淀。让裂解物在室温下静置 2 分钟。

8、以 12,000 × g 离心 5 分钟。将上清液转移到离心柱中。

9、以 12,000 × g 离心 1 分钟。丢弃流过。

10、向柱中加入 650 µl 工作洗涤缓冲液（加乙醇），然后以 12,000 × g 离心 1 分钟。丢弃流过。

11、将空柱以 12,000 × g 离心 1-2 分钟，以完全去除任何残留的洗涤缓冲液。

12、将离心柱放入干净的微量离心管中，然后将 30-100 µl 洗脱缓冲液或无菌蒸馏水 (pH > 7.0) 直接添加到柱基质的中心。为获得更高的产量，请将洗脱缓冲液或水预热至 65 °C）。让色谱柱在室温下静置 1 分钟。以 10,000 × g 离心柱 1 分钟以洗脱 DNA。分离的质粒 DNA 可以立即使用，也可以储存在-20°C。

注：

1、在室温下进行所有离心步骤。

2、使用前，请检查 Lysis Buffer 溶液是否混浊。如果浑浊，将瓶子在设置为 37 °C 的水浴中加热，以确保所有内容物都完全溶解。使用后立即拧紧瓶盖以避免 pH 值变化。

3、该试剂盒的zui 大 DNA 产量为 40 µg。如果质粒 DNA 产量低，增加细菌培养量。

4、使用上述建议的工作重悬缓冲液、裂解缓冲液和中和缓冲液的体积，因为过多的细胞培养会导致不完全裂解，从而影响质粒 DNA 的产量和纯度。

5、5 ml LB 培养基相当于 1 次 rxn。