Biospin质粒DNA小量提取试剂盒检测 一、基础知识 质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中,它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质,如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可以正常存活。 二、实验目的 1,掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用。 2,检测该商品是否合格。 三、实验原理 从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤:培养细菌使质粒扩增→收集和裂解细胞→分离和纯化质粒DNA。 采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁,十二烷基磺酸钠(SDS)和Triton X-100可使细胞膜裂解。 经溶菌酶和SDS或Triton X-100处理后,细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上,同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多,易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。当用强热或酸、碱处理时,细菌的线性染色体DNA变性,而共价闭合环状DNA(Covalently closed circular DNA,简称cccDNA)的两条链不会相互分开,当外界条件恢复正常时,线状染色体DNA片段难以复性,而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起,而质粒DNA双链又恢复原状,重新形成天然的超螺旋分子,并以溶解状态存在于液相中。 材料:1—1.5ml过夜培养的E.coli菌液、1.5ml离心管、离心管架、手套、 Spin column、中枪头、大枪头、平板纸 设备:20—200ul的移液器、100—1000ul的移液器、台式高速离心机、涡旋振荡器, 电泳仪,琼脂糖平板电泳装置、恒温水浴锅等 试剂:RNA酶溶液、Resuspension Buffer、细胞Lysis Buffer、Neutralization Buffer、Wash Buffer、无水乙醇、Elution Buffer、取离子水或TE溶液 五、 实验步骤 (一)质粒提取 (培养大肠杆菌)→收集菌体→重悬菌体→裂解细胞→沉淀除杂→离心初步纯化→膜过滤纯化→洗脱收集质粒DNA 1,将1ml过夜培养的细菌菌液加入1.5ml离心管中 2, 3,加250ul Resuspension Buffer,剧烈振荡,使菌体沉淀重新悬浮至没有细菌团块,加RNA酶溶液,2— 4,加250ul细胞Lysis Buffer,轻柔颠倒4—6次,冰浴5分钟(不要剧烈振动,以防止基因组DNA被剪切。反应不超过5分钟) 5,加350ul预冷的Neutralization Buffer,立即轻柔颠倒离心管4—6次,冰浴中5-10分钟(溶液应该出现絮状物,但不会出现局部沉淀) 6, 7,将上清液转移到Spin column内, 8,按Wash Buffer瓶身标签标明体积加入无水乙醇,并将其混匀 9,向Spin column内加650ul Wash Buffer, 10,重复第9步 11, 12,向Spin column内加50ul Elution Buffer、去离子水或TE溶液,并于室温静置1分钟(洗脱液体积可根据实验的实际需要决定) 13, (二)质粒检测 1,琼脂糖电泳检测(0.8—1﹪ Agarose gel):质粒电泳一般有三条带,分别为质粒的超螺旋、开环、线型三种构型 浓度(ug/ml)=50×OD 260nm×稀释后的体积 目标 2.0≧OD 260-320nm/ OD 280-320nm≧1.8 1.0≧OD 260nm≧0.1,the result of ratio is much reliable 若吸光值260nm/280nm的比值介于1.7-1.9之间,说明质粒质量较好,1.8为最佳,低于1.8说明有蛋白质污染,大于1.8说明有RNA污染 六、 注意事项 1,实验前检查细胞Lysis Buffer、Neutralization Buffer是否有沉淀,如果有沉淀用37℃温浴溶解 2,不要剧烈摇晃Lysis Buffer 3,提取过程应尽量保持低温 七、 常见问题及对策 1,没有提取到质粒 如在洗脱后,发现溶液中没有质粒DNA,请检查是否按Wash Buffer瓶身标签标明的体积加入了无水乙醇 2,质粒提取率低 ① 请先确认培养的细菌,配出培养过程中的杂菌污染、质粒丢失等原因 ② 加入重悬也后应使菌体沉淀充分悬浮分散 ③ 在洗脱前将Elution Buffer于30—60℃温育,可提高提取效率 3,吸光度测量结果问题 ① 吸光度测量的是未知样品与调零标准之间的相对吸光度,所以请用与洗脱液体相同的液体,对测量样品进行稀释和调零 ② OD 260nm/280nm的比值偏低,可用Wash Buffer多一次对离心柱进行洗涤 ③ 如OD 260-320nm/ OD 280-320nm的比值偏低,说明有蛋白质污染。应在加入Neutralization Buffer后,以足够高的转速离心,使沉淀紧密,并小心地吸取上清液,避免吸入沉淀 ④ 如OD 260-320nm/ OD 280-320nm的比值偏高,说明有RNA污染,请在重悬液中加入RNase A至终浓度100ug/ml 4,电泳结果问题 ① 有基因组条带。在加入Lysis Buffer、Neutralization Buffer后,颠倒离心管应柔和,以避免基因组DNA收到剪切 ② 有RNA污染。请在重悬液中加入RNase A至终浓度100ug/ml |
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