GST表达融合蛋白 载体 pGEX-KG 大小:5006bp,氨苄青霉素抗性(Ampr),IPTG诱导表达 酶切位点:BamHI 930、SmaI 937、EcoRI 962、XbaI 966、NcoI 974、SalI 980、XhoI 985、SacI 992、HindIII 994 GST分子量: 构建pGEX-KG-YFG重组 质粒 1、分析所感兴趣的基因(your favorite gene, YFG) Primer Premier 5.0软件,分析YFG含有哪些酶切位点,注意是否与pGEX-KG载体 的多克隆位点有重合 2、确定合适的双酶切位点 NEB网站(www.neb.com) Double Digest Finder软件 ,查找最佳双酶切组合(下表)
对照YFG、载体多克隆位点,确定上、下游酶切位点 3、设计PCR上、下游引物 Primer Premier 5.0软件,设计PCR上、下游引物 酶切位点外最多含6个碱基 3’端不是A,最好是G或C,但是不推荐使用GC或CG结尾 3’端至少保证有10个碱基完全配对 得分(Rating)大于70 [注意] 上游引物:是否添加适当碱基,确保不打乱开放阅读框 下游引物:添加终止密码子(UAA、UAG、UGA) 4、引物合成及保存 合成:上海生工生物工程技术服务有限公司(Email:beijing@sangon.com,Tel:81767586);纯化方法:柱层析or聚丙烯酰胺凝胶电泳?;价格1.30/碱基 保存:贮存浓度:100pmol/μl(100μM),工作浓度:10pmol/μl(10μM),-20°C保存 5、PCR扩增YFG 模板:质粒10ng/μl 稀释少量 -20°C保存 引物:10pmol/μl(10μM) -20°C保存 Taq酶:NEB Quick-Load Taq 2×Master Mix 扩增片段小于2.0kb 反应体系(配制时置于冰上)
(1) 预变性 94°C 5 min (2) 变性 94°C 30 s (3) 退火 待定 30 s (4) 延伸 72°C 待定 (5) 重复2-5 25-30个循环 (6) 补平缺口 72°C 10 min (7) 暂存 10°C [注意] 退火温度:参考4(G+C)+2(A+T)-4(互补碱基),参考Ta Opt(Primer Premier 5.0) 延伸时间:Taq酶:1kb/min 循环数小于30,减少错配 琼脂糖电泳检测PCR产物 0.8%有效分离范围:10~0.8kb;1.0%有效分离浓度7~0.5kb 50ml TAE加入5μl EB母液(5mg/ml) 100V,30-45min 拍照或者紫外灯下切胶回收 6、构建pGEX-KG-YFG 酶切:双酶切PCR产物、pGEX-KG 回收:PCR产物直接回收、pGEX-KG电泳之后切胶回收 连接:pGEX-KG 50ng、插入片段150ng 转化铺平板:Ampr 挑单克隆:Ampr(四个菌落足够了) 鉴定:小提质粒酶切 or菌体 PCR 7、转化BL21(DE3)pLysS菌株检测GST融合蛋白的表达 (1)冰上融化BL21(DE3)pLysS感受态细胞(天根) (2)2 ml离心管中,加入25μl BL21+ 3μl质粒(300-500ng),混匀(质粒≤感受态1/10) (3)冰上放置30min (4)42°C,90s (5)冰上放置2-3min (6)加入300μl LB(无抗生素)(相当于菌体10倍体积的LB),37°C,250rpm,1 h (7)4000rpm,2min,弃上清,其余混匀以后涂平板(Ampr),37°C,过夜(16 h) (8)挑单克隆菌落,5ml LB(Ampr),37°C,250rpm,过夜(16 h) ()稀释10倍、20倍、50倍测定OD600 ()选择合适的稀释倍数,5ml菌液,37°C,250 rpm,1 h,测定OD600 (7)取100μl菌液加入5ml LB(Ampr)(50倍稀释),37°C,250rpm,过夜(16 h) (8)取500μl菌液加入5ml LB(Ampr)(10倍稀释)(其余菌液4°C保存),测OD600 (9)37°C,250 rpm,2 h(OD600:0.6-0.8),测OD600 (10)室温放置20 min(摇床降温,30°C) (11)取100μl作为诱导前对照,冰上放置 (12)菌液中加入IPTG,终浓度0.5-1 mM (13)30°C,250 rpm,2 -4h(可做时间梯度),测OD600 (14)取100μl作为诱导后对照,连同诱导前菌液,12000rpm,离心2min,加入50μl 1×SDS上样缓冲液 (15)取4ml菌液,12000rpm,离心2min,收集到2ml离心管中 (16)加入1ml GST裂解缓冲液重悬菌体 (17)超声破碎细胞:超声20s,间隔10s,共3-5次,超声强度200-300W(冰浴) (18)超声后菌液换入一个新1.5ml离心管,4°C,12000rpm,离心5min (19)超声后上清:取25μl上清,加入25μl 2×SDS上样缓冲液(其余上清-80°C保存) (20)超声后沉淀:沉淀加入1ml GST裂解缓冲液重悬,取25μl,加入25μl 2×SDS上样缓冲液(其余沉淀-80°C保存) (21)将四个样品煮沸3min,12000rpm,离心5min (22)8-10%SDS-PAGE,30μl上样,顺序:诱导前菌体、诱导后菌体、超声后上清、超声后沉淀 (23)考马斯亮蓝染色 [注意](1)菌液OD值小于1即可 (2)诱导时间最好做一个梯度,2-6h (3)诱导温度适当摸索,24°C、30°C (4)IPTG浓度可做梯度,1mM (5)超声条件可视实际情况改变,只要使细菌裂解充分即可,即菌液清亮不粘稠 8、测序确认 测序引物:pGEX-3通用引物 测序样品:过夜菌1ml;质粒(浓度大于50ng/μl,10μl) 9、中提质粒(Promega) 10、表达纯化GST融合蛋白 (1)已经转化的菌液,或者重新转化BL21(DE3)pLysS(2)活化:取20μl菌液加入11ml LB(Ampr)(500倍稀释),37°C,250rpm,过夜(16 h) (3)取10ml菌液加入100ml LB(Ampr)(10倍稀释)(剩余菌液4°C保存) (4)37°C,250 rpm,1 h 10 min-1 h 20 min,OD600 0.6-0.8(OD600小于1.0即可) (5)取1ml菌液作为诱导前对照,冰上放置 (6)加入IPTG,终浓度1 mM (7)30°C,250rpm,诱导适当时间(预实验确定) (8)取1ml菌液作为诱导后对照,连同诱导前菌液,12000rpm,离心2min,收集菌体,加入100μl 1×SDS上样缓冲液 (9)其余菌液,分为两份,倒入50ml离心管,5000rpm,离心20 min,收集细胞 (10)每管加入8-10ml GST裂解缓冲液重悬菌体,转移小烧杯中(无气泡) (11)超声破碎细胞:超声3s,间隔10s,40次左右,超声强度200-300W(冰浴) (12)将超声后菌液转移到50ml离心管中,4°C,13000rpm,离心20-30min (13)将上清转移到1个50ml离心管中,取出50μl,加入50μl 2×SDS上样缓冲液(其余上清-80°C保存) (14)将沉淀加入16-20ml GST裂解缓冲液(或PBS)重悬,取出50μl,加入50μl 2×SDS上样缓冲液(其余沉淀-80°C保存) (15)将四个样品煮沸3min,12000rpm,离心5min (16)8-10%SDS-PAGE检测诱导、超声是否合适,30μl上样,顺序:诱导前菌体、诱导后菌体、超声后上清、超声后沉淀 (17)考马斯亮蓝染色 (18)混匀glutathione sepharose beads(4B)(mixed slurry),取200μl加入15ml离心管中(2份) (19)加入10ml PBS,混匀,3000rpm,离心3min,弃上清 (20)加入超声后上清液,4°C轻柔摇荡60分钟(或过夜)(横放) (21)4°C,3000rpm,离心3min (22)10ml GST裂解缓冲液洗涤2次(冰上) (23)10ml TBS(含5mM MgCl2、1mM DTT)洗涤2次(冰上) (24)弃上清,加入1倍柱床体积的TBS(含5mM MgCl2、1mM DTT、50%甘油),混匀 (25)取悬液测定蛋白浓度或SDS-PAGE (26)-20°C保存beads 11、GST-Pull-down (1)10cm培养皿中,未处理的细胞或者转染的细胞(3-5μg质粒转染10cm培养皿,Cos-7、293T或者其他细胞,转染24h) (2)加入1ml 细胞裂解缓冲液,细胞铲刮下细胞(冰上) (3)将裂解液收集到1.5ml离心管中,振荡30s,冰上放置5min,重复2-3次,充分裂解细胞 (4)4°C,12000rpm,离心15min,收集上清 (5)测定蛋白浓度,取1mg总蛋白做GST-Pull-down? (6)留30μl作为input对照(input与Pull-down蛋白量约为1/10) (7)其余溶液,加入20μl glutathione sepharose beads(PBS洗涤过),4°C,轻柔振荡20min (8)12000rpm,离心3min (9)收集上清,分为两份,一份加入1-15μg GST结合的beads,另一份加入等量 GST-融合蛋白结合的beads,4°C,轻柔振荡60min (10)3000rpm,离心3min,回收上清 (11)1ml 细胞裂解缓冲液洗涤3次 (12)弃尽上清,加入25μl 2×SDS上样缓冲液 (13)煮沸3min,12000rpm,离心3min (14)SDS-PAGE,上样顺序:细胞裂解液input、x、GST、x、GST-融合蛋白(x:LSB) (15)考马斯亮蓝染色或免疫印迹 [附录] GST裂解缓冲液(前四个组分配好之后4°C保存,DTT和蛋白酶抑制剂现用现加) 配方一
配方二
常用IP细胞裂解液
cleared lysates were incubated for 1.5 h with 3 μg immobilized GST or GST-32 |
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