非常欢迎啊! 一、什么是RPKM、 FPKM、TPM、CPMRPKM, FPKM and TPM, clearly explained - StatQuest!!! RPKMRPKM (Reads Per Kilobase Million, or Reads Per Kilobase of transcript per Million reads mapped) 计算RPKM的方法:
FPKMFPKM (Fragments Per Kilobase Million, or Fragments Per Kilobase of transcript per Million reads mapped) 每千个碱基的转录每百万映射读取的fragments FPKM与RPKM非常相似。RPKM是针对单端测序的RNA-seq而言的,其中每个reads对应于一个已测序的单个片段。FPKM用于双端测序的RNA-seq。使用双端测序RNA-seq,两个reads可以对应一个片段(Fragment)。RPKM和FPKM之间的唯一区别是FPKM考虑到两次reads可以映射到一个片段(因此它不会对该片段进行两次计数)。 TPMTPM (Transcripts Per Million, or Transcripts Per kilobase of exon model per Million mapped reads) 计算TPM的方法:
因此在计算TPM时,与RPKM、 FPKM相比,唯一的区别是TPM先对基因长度进行标准化,然后对测序深度进行标准化。但是,这种差异的影响非常深远。因为使用TPM时,每个样本中所有TPM的总和是相同的,这样可以更轻松地比较每个样本中映射到基因的读数的比例。相反,使用RPKM和FPKM,每个样本中的标准化读数之和可能会有所不同,这使得直接比较样本变得更加困难。 CPMCPM(Counts Per Million, or Counts of exon model Per Million mapped reads) 每百万映射读取的counts 除了RPKM、 FPKM、TPM这几种方法,CPM也是较为常见的一种基因定量方式。原始的表达量除以该样本表达量的总和,再乘以一百万,即可得到CPM值。CPM值只对测序深度进行了标准化,一般利用edgeR包的cpm()函数即可对基因counts进行简单校正 。 二、由Counts计算FPKM/RPKM和TPM有许多文章已经给出了这几种计数方式的计算和转化关系,如What the FPKM? A review of RNA-Seq expression units | The farrago (wordpress.com)。 countToTpm <- function(counts, effLen) { rate <- log(counts) - log(effLen) denom <- log(sum(exp(rate))) exp(rate - denom + log(1e6)) } countToFpkm <- function(counts, effLen) { N <- sum(counts) exp( log(counts) + log(1e9) - log(effLen) - log(N) ) } fpkmToTpm <- function(fpkm) { exp(log(fpkm) - log(sum(fpkm)) + log(1e6)) } countToEffCounts <- function(counts, len, effLen) { counts * (len / effLen) } ################################################################################ # An example ################################################################################ cnts <- c(4250, 3300, 200, 1750, 50, 0) lens <- c(900, 1020, 2000, 770, 3000, 1777) countDf <- data.frame(count = cnts, length = lens)# assume a mean(FLD) = 203.7 countDf$effLength <- countDf$length - 203.7 + 1 countDf$tpm <- with(countDf, countToTpm(count, effLength)) countDf$fpkm <- with(countDf, countToFpkm(count, effLength)) with(countDf, all.equal(tpm, fpkmToTpm(fpkm))) countDf$effCounts <- with(countDf, countToEffCounts(count, length, effLength)) 为了更清楚直观地明白FPKM/RPKM和TPM的计算过程,根据StatQuest定义给出的计算方法,自己重新写了由counts转化为FPKM/RPKM和TPM的计算公式代码,经过验证其结果与上面公式所得结果一致,那今后就用自己写的这些代码吧,具体代码如下:
要注意一点的是计算FPKM/RPKM和TPM时,基因长度一般指的都是基因的有效长度effective length,即该基因的外显子总长度或转录本总长度,以此为标准来消除测序造成的基因长度影响才更为准确。 可参见生信技能树文章:基因长度之多少 | 生信菜鸟团 (bio-info-trainee.com) 关于如何得到基因有效长度,请参阅文章:获取基因有效长度的N种方法。 参考资料:RPKM, FPKM and TPM, clearly explained - StatQuest!!!What the FPKM? A review of RNA-Seq expression units | The farrago (wordpress.com)RPKM、FPKM、TPM详解RNA-seq的counts值,RPM, RPKM, FPKM, TPM 的异同 - 云+社区 - 腾讯云 (tencent.com) |
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