｜医学简讯｜真皮成纤维细胞产生的皮肤老化相关分泌蛋白的特征

皮肤老化的特征之一是真皮结构和功能的改变。其中，真皮间质主要由成纤维细胞及其周围基质组成，处于有丝分裂期后的静止状态，其中功能失调的细胞会随着时间的推移而发生累积。因此，真皮的内稳态很大程度上依赖于细胞的适应性和其对损伤的清除能力。在老化进程中，成纤维细胞所呈现的适应性或非适应性反应，被认为是一种遗传决定的细胞程序性衰老，会限制细胞的增殖。研究显示，在体外培养的皮肤成纤维细胞中，可复制的端粒缩短（复制性衰老）或应激诱导的过早衰老是导致细胞老化的主要原因，由此产生的老化表型包括不可逆的细胞周期阻滞、细胞扁平化和扩张、异染色质化增强和老化相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype，SASP）的出现，这在某种程度上也需要 “染色质异常的DNA片段加重的衰老（DNA segments with chromatin alterations reinforcing senescence，DNA-SCARS）”的参与。这些发现与人类老化皮肤中成纤维细胞（即原位老化成纤维细胞）的相关性尚不清楚，因为大多数研究使用的是经长期传代而进入复制性衰老的培养细胞，或因过度表达致癌基因以及由应激（包括电离辐射等）诱导的核DNA损伤而进入衰老期的培养细胞。

真皮成纤维细胞产生的皮肤老化相关分泌蛋白的特征

一、材料和方法详见原文

二、结果和讨论

为了探讨体外老化成纤维细胞中存在的细胞衰老特征是否也存在于原位老化（即人类皮肤中）的成纤维细胞中，研究者从3个不同年龄组（20 ~ 29岁组，40 ~ 49岁组和 ≥ 60岁组；每组5人）捐赠者的皮肤样本中分离出正常的人原代真皮成纤维细胞（normal human dermal fibroblasts， NHDFs）。同时确保：（i）对所有细胞都在传代早期（传代数 ≤ 6）的指数增长阶段进行研究；（ii）为避免激素以及其他性别特异性的影响，成纤维细胞全部来自女性捐赠者；（iii）所有细胞均分离自内源性老化程度相同的皮肤区域（即女性乳房底部的边缘），这样可以最大程度地减小由于身体部位或不同的外部环境暴露所导致的差异。由60岁以上女性捐赠者组成的第3组很可能已经绝经，这也是体内皮肤老化的因素之一，所以不作为该研究的限制因素。

研究者首先测量了端粒限制性片段长度（telomere restriction fragment length），观察到在相同的早期传代（传代数 < 5）的研究条件下，所有细胞的端粒限制性片段长度值都相似，约为3.6 kb。因此，培养的原位老化NHDFs不会出现程度显著的可复制的端粒缩短。因为在细胞中并未发现与捐赠者年龄增加相关的细胞凋亡标记物（膜联蛋白V）和细胞坏死/晚期凋亡标记物（碘化丙锭）的升高，因此也排除了数据中由于复制性衰老导致细胞存活率降低的影响。

有研究者确认DNA-SCARS的特征为53BP1/早幼粒细胞白血病（promyelocytic leukemia protein，PML）蛋白阳性的细胞核位点，存在于老化的人体细胞和小鼠组织中。该研究则显示53BP1和PML双阳性的大的细胞核位点，且这些位点在老年捐赠者的细胞中更为常见。包含一个或多个这种位点的细胞所占的比例随年龄增长而增加。严格来说，DNA-SCARS的特征是每个细胞有4个或更多个53BP1/PML的双阳性位点。假设这些拥有完整DNA-SCARS的细胞停止增殖，那么它们大多会从该研究的培养模型中丢失，而上述观察到的随年龄增长比例增加的细胞中会出现至少一个核53BP1/PML阳性位点，出现阳性位点细胞的比例可以反映细胞体系中早期老化程度的增加。根据这一观点，53BP1/PML双阳性位点DNA-SCARS的定量评分与基础γ组蛋白2AX（H2AX）的水平没有显著相关性，后者是组蛋白变异的H2AX的磷脂酰肌醇3′激酶相关的激酶磷酸化形式，也是已知的DNA双链断裂标记物。

DNA-SCARS被认为在SASP的维持中发挥作用。因此，研究者也评估了培养的原位老化NHDFs是否也表现出经典的SASP。为此研究者使用高分辨率质谱分析联合候选驱动的方法，对处理后的细胞培养上清液进行整体分泌蛋白质组定量。值得注意的是，这些分泌蛋白质组的分析是针对需氧（20% O2）的二维培养条件下处于对数生长期的细胞进行的，与生理情况下真皮间质中静止的、基本无氧的状态不同，这是NHDFs的一种应激态。此外，对细胞培养基的分析无法考虑到体内细胞老化过程中的组织环境因素和细胞外基质（ECM）影响，而这些因素已被证实在体内细胞老化中起着重要作用。

经过对老年和年轻捐赠者皮肤样本NHDFs培养物的分泌蛋白质组的整体分析，鉴定出1 331种独特的蛋白，确定其为分泌蛋白。这些蛋白中，531种通过Signal P被证实具有可分泌的N末端信号序列，336种通过Secretome P被预测具有与非经典途径分泌相关的序列特征， 44种已被确认是细胞外蛋白， 336种因其生物学功能被确定为细胞外因子［如成纤维细胞生长因子和白细胞介素（IL）］，经各种非经典途径被分泌。此外，该研究在分泌蛋白中鉴定出几种膜相关蛋白，如CD14、钙黏蛋白2（cadherin-2，CDH2）、半乳凝素1、凝集素、甘露糖结合蛋白2（mannose binding protein 2，LMAN2）、黏蛋白16和组织因子通路抑制剂（tissue factor pathway inhibitor，TFPI）。其中4种蛋白的分泌丰度呈明显改变，即CD14、CDH2、LMAN2和TFPI。这为蛋白脱落（protein shedding）在培养的NHDFs原位老化中发挥作用提供了证据。CD14可能是血管内皮生长因子（一种已知的SASP因子）生成过程中的关键调控因子，被认为与皮肤老化密切相关，其表达在培养的原位老化NHDFs分泌蛋白质组中增加3.1倍。而CDH2则明显降低（5.4倍）。在老年捐赠者的NHDFs分泌蛋白质组中，LMAN2的含量也降低1.5倍，它一般被认为是来自巨噬细胞，对吞噬过程具有调节作用。但此前从未有过关于LMAN2由成纤维细胞分泌或者与皮肤老化相关的描述。TFPI也是如此，其含量在培养的原位老化NHDFs中降低1.8倍，被认为可以维持血管系统的凝血与抗凝血平衡。

该研究共纳入66种跨膜或膜相关蛋白作为分泌表型的候选蛋白。研究者通过无偏倚蛋白质组学研究方法，共鉴定出977种可能通过经典或非经典途径分泌的独特蛋白，同时排除354种可能的蛋白污染物。通过该方法只检测出3种细胞因子，由于细胞因子是涉及SASP旁分泌和自分泌效应的相关因子，因此这一极低的数据令人怀疑。研究者猜测可能有更多的细胞因子被分泌，但由于体积小、胰酶肽不足和/或浓度低，所以未被检测到。为了解决这一问题，研究者还通过靶向方法对细胞因子进行分析，检测并确认了另外21种细胞因子的存在。总之，研究者在培养的原位老化NHDFs分泌蛋白质组中共鉴定出998种蛋白，这是一个相对较高的数字。

接下来，对上述998种分泌蛋白，研究者进行了详细的功能注释分析，确定14个不同的生物进程，包括凋亡、 细胞周期、细胞-细胞信息传递、 ECM构成、凝血与抗凝血、蛋白质代谢和信号转导等，每个进程和阶段至少有5种特定的蛋白质在分泌蛋白质组中富集。其中，ECM构成是最为丰富的进程。此外，检测到的免疫系统和凝血与抗凝进程可能反映了成纤维细胞在伤口愈合和炎症中的作用。然而不同年龄组的比较结果显示，培养细胞的老化情况各组间没有明显的差异。值得注意的是，在所有被定量的蛋白中，大约30%在老化过程中的丰度是稳定不变的。研究者还使用Consensus Path数据库对与捐赠者年龄无关的分泌蛋白进行分类，结果表明碳水化合物代谢、分解代谢、发育过程、激素代谢和细胞外结构建立是突出的生物进程。因此，培养的NHDFs原位老化过程只是伴随着分泌蛋白质组的轻微而不是剧烈的变化。

为了检测年龄相关的变化模式，该研究在单个蛋白水平上检测了与年龄相关的改变，通过高分辨液相色谱质谱联用法分析鉴定出63种分泌蛋白在老化过程中发生了丰度变化。此外，使用靶向方法鉴定出7种蛋白随着年龄增长明显增加，即IL-1B、IL-1RN、IL-4、IL-15、干扰素G、C-X-C基序趋化因子样10（C-X-C motif chemokine like-10，CXCL10）和肿瘤坏死因子α。

在随后的分析中，根据蛋白的分泌丰度随年龄的变化轨迹，这些分泌蛋白被分为“即时”、“近期”和“长期”3组调节蛋白。“即时”组包括39种蛋白，与年轻捐赠者相比较，中年捐赠者的细胞上清液中的上述蛋白含量明显增加或降低。几乎所有表现出“即时”、“近期”、“长期”特征并且分泌丰度随年龄增加而减少的蛋白都与ECM重构有关。相反，分泌丰度随年龄增加而增加的蛋白则具有与细胞周期停滞相关的更多样化的细胞功能。

结合二元分析方法，该研究鉴定出的70种分泌蛋白显示了培养的原位老化NHDFs分泌表型的改变，可能与人类皮肤的内源性老化有关。而这组蛋白也被称为皮肤老化相关分泌蛋白（skin aging associated secreted proteins，SAASP）。

接下来探讨可能与培养的NHDFs分泌蛋白质组的特异性改变有关的生物进程，这可能出现在原位皮肤内源性老化的过程中。为此，该研究使用Reactome数据库对70种SAASP进行详细的增强网络分析。其中45种SAASP（64.3%）被成功匹配至可能与细胞分泌表型的改变有关的独特生物进程中。P值最低的4个生物进程与ECM重构有关，即“细胞外基质构成”（P = 4.1 × 10^-8）、“弹性纤维形成”（P = 3.1 × 10^-6）、“基质金属蛋白酶激活”（P = 2.6 × 10^-5）和“胶原降解”（P = 5.8 × 10^-5）。此外，该研究将“鞘糖脂代谢”（P = 6.4 × 10^-5）、“胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，IGF）结合蛋白对IGF转运和摄取的调控” （P = 1.6 × 10^-4）、“与弹性纤维有关的分子”（P = 4.8 × 10^-4）和“鞘脂类代谢”（P = 6.7 × 10^-4）鉴定为与SAASP相关的显著增强的生物进程。

接下来要解决的问题是，与培养的NHDFs内源性老化相关的分泌表型（即SAASP）是否与成纤维细胞中出现的导致复制性或应激诱导的过早衰老的经典SASP相同。在培养的原位老化成纤维细胞分泌蛋白质组中发现的998种分泌蛋白中，鉴定出43种SASP因子。9种SASP因子被纳入SAASP组，即NHDFs的分泌丰度表现出年龄相关性变化。其中8种因子的分泌丰度随年龄增加而增加［IL-8：8.1倍；IL-1b：4.0倍；基质金属蛋白酶（MMP）：3.9倍；MMP-10：3.2倍；MMP-3：3.0倍；干扰素γ：2.6倍；IL-15：2.0倍；MMP-14：1.4倍］，另外1种的分泌丰度则随年龄增加而减少（IGF结合蛋白6减少2.8倍）。因为该研究中用于检测SASP因子的分析平台与文献中的不同，所以不能排除系统固有偏差导致的候选蛋白的代表性不足。因此，研究者决定同时考虑候选蛋白的生物进程，以期提高对于SASP与SAASP因子之间的覆盖，并进行更详细的增强网络分析。结果显示，使用Reactome数据库，共有141种蛋白（94.0%）被成功匹配到239个生物进程中。其中33个生物进程（93种蛋白）被确定由SASP和SAASP调控的蛋白网络所共有。对于关键生物进程的对比结果显示，趋化因子受体结合趋化因子/经IL信号传导（P = 4.2 × 10^-14）、IGF结合蛋白对IGF活性的调控（P = 7.9 × 10^-8）和MMP的激活/ECM的降解（P = 1.5 × 10^-7/P = 4.4 × 10^-5）为SASP和SAASP蛋白之间共有的生物进程。

在上述239个生物进程中，126个（73种蛋白质）是SASP蛋白独有的。这些生物进程包括整合素细胞表面相互作用（P = 1.9 × 10^-9）、纤维蛋白凝块溶解（P = 1.5 × 10^-4）和人表皮生长因子受体2信号转导中的生长因子受体结合蛋白2（P = 2.8 × 10^-4）；81个生物进程（33种蛋白）是SAASP独有的，这些进程包括代谢［P = 6.0 × 10^-4，可细分为鞘糖脂/鞘脂类代谢（P值分别为2.1 × 10^-3和1.9 × 10^-2）］、嘌呤分解代谢（P = 1.4 × 10^-1）、谷胱甘肽合成和再循环（P = 1.3 × 10^-1）、碳水化合物代谢（P = 5.8 × 10^-1）和黏附连接相互作用（P = 6.4 × 10^-2）。据了解，鞘脂类/鞘糖脂代谢的进程之前并没有被描述为与细胞衰老或皮肤老化直接相关。该研究鉴定出的属于这一生物进程的蛋白包括葡萄糖神经酰胺酶（上调）、唾液酸酶1（上调）、激活蛋白原（下调）和硫酸酯酶修饰因子1（下调）。所有这些蛋白的至少部分功能丧失与溶酶体储存障碍有关，可能会多少伴有严重的鱼鳞病。重组人唾液酸酶（NEU1）在弹性纤维和ECM的正常组装中也是必需的，但是之前并没有被描述为与（皮肤）老化相关。为了验证这一发现的体内相关性，研究者在不同年龄捐赠者的石蜡包埋皮肤切片上进行了成纤维细胞标记物波形蛋白和NEU1的荧光共染色，并使用一种图像处理算法自动识别波形蛋白/NEU1双阳性细胞群。定量和Pearson分析显示，组织切片中NEU1的表达随年龄增加而显著增加，因为不同组中波形蛋白阳性细胞的数量保持不变，因此这并不是由于老年组的成纤维细胞数量总体增加而导致的。

“谷胱甘肽合成和再循环”的过程反映在γ-谷氨酰环化转移酶（γ-glutamylcyclo-transferase）上，该酶在γ谷氨酰循环中起到关键作用，这是谷胱甘肽合成和降解以及药物/外源化合物解毒的一种途径，其含量在培养的原位老化NHDFs中被下调，可能表明内源性老化皮肤的解毒能力缺失。该研究还检测和比较了皮肤中表达的谷胱甘肽S-转移酶（GST）两种主要的异构体GSTπ和GSTα4。与年轻组相比，中老年供体的NHDFs中GSTπ mRNA水平仅略有降低，而GSTα4 mRNA水平则在年龄较大的两组中均呈显著性降低；GST酶活性在中年组也显著性降低。由于研究中用于测定GST活性的底物1-氯-2,4-二硝基苯对该酶的两种异构体都没有特异性，所以可能导致老年组的数据缺乏统计学意义。

 “代谢”这个综合术语的生物学过程主要指“碳水化合物代谢”，以烯醇酶2和prolargin（一种富含亮氨酸的小蛋白聚糖）为代表，该研究中，烯醇酶在细胞上清液中随捐赠者年龄的增加而下调；相反， prolargin则被上调。该研究发现的一个SAASP相关的生物进程是“黏附连接相互作用”的改变，并以蛋白CDH2和CDH11为标志。

总之，目前研究清楚地表明，体外成纤维细胞老化的部分特征可以在培养的人成纤维细胞（分离自内源性老化的皮肤）中检测到。这与之前的报道一致，即在灵长类动物和人类的老化皮肤中，表达老化标记物的细胞比例增加。最重要的一点是，该研究显示培养的原位老化皮肤成纤维细胞会表达一种分泌蛋白质组，并将其命名为SAASP。与经典SASP不同，SAASP可能与内源性皮肤老化的功能相关，但仍需要进一步的研究来验证这些发现。

［陈旭  孔佩慧  牛悦青 摘自Daniel L, Faiza K, Kai S, et al. Characterization of skin aging-associated secreted proteins （SAASP） produced by dermal fibroblasts isolated from intrinsically aged human skin［J］. J Invest Dermatol, 2015,135（8）:1954-1968.］

原研究单位：德国杜赛尔多夫大学、德国海德堡大学、德国癌症研究中心（海德堡）、欧莱雅法国研发和创新中心