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*题目中的干细胞专指间充质干细胞* 不知何时起，干细胞行业内开始流行这么一个观点：无血清培养基比含血清培养基更安全。随便咨询一个业内人员、专家或非专业人士，都张口回答是用无血清培养基来培养的干细胞，好像无血清培养基比含血清培养更高级更安全。 要科学地审视这个观点，就需要清楚两个问题：一是“什么是无血清培养基”，二是“培养基的安全性涵盖哪些内容”。额外赠送两个问题，即①血小板（裂解物）和血清的优略势、②大力推广无血清培养基的后续社会影响如何。 答案很简单，即不含血清的培养基。也有一观点认为血清含量低于2%即可认为不含血清。 那么，什么是血清？为何对血清心怀如此的不满？ 血清就是血液或血浆经过凝血处理（血小板激活）后上清液，因为有血小板激活释放多种生长因子的过程，所以血清中多种生长因子的含量超过血浆。正因为血清中富含多种生长因子，所以一直以来用血清来培养细胞，而不是直接用血浆来培养细胞。 简而言之，血清来源于血浆（或血液），血浆（或血液）经过凝血处理（血小板激活）得到血清，除了血小板激活这个过程所带来的生长因子的浓度变化，血浆和血清的其他组份没有明显的差异（相对培养细胞而言）。 目前所有的间充质干细胞（MSC）培养基由两部分组成，基础培养基+补充液。补充液弥补了基础培养基无法促进MSC贴壁和增殖的缺点。无血清培养基和含血清培养基的区别，就是在于补充液里面是否含血清。补充液中，如果不含血清（血清中含生长因子），那么MSC是不可能生长增殖的，所以，补充液中就必须含有生长因子。如果只是添加生长因子（不添加血清或者血小板裂解物），那么MSC也是很难贴壁和生长增殖。想一想，由各种各样的细胞构成的人体，需要血液（血浆里面的营养）来维持生命；细胞也不例外，也需要血浆里面的营养。 所以，如果不含血清，那就必须用血清替代物，目前常见的血清替代物就是血小板（裂解物），因为血小板激活后释放多种生长因子，同样也能促进MSC的生长增殖。 那么这里出现了直击灵魂的问题：血小板从哪里来？血清从哪里来？ 血小板从哪里来？从血浆（抗凝）中分离出来。 血清从哪里来？从血浆（促凝）中分离出来。 故，血小板和血清都是来源于血浆。血浆从哪里来？血液去除血液细胞后，就是血浆。尽管血浆含有许多营养物质和多种生长因子（低浓度），但是缺乏血小板活化释放的多种生长因子（高浓度），因此单纯的血浆很少用于培养MSCs的补充剂[1]。 都是从血浆获得，凭什么血小板就比血清更安全？这也许是“想当然”的结果（高级智商税或其他）。下面的一张表格，就总结了血液产品（包括血浆和血小板）所携带的常见致病微生物。所以，血清和血小板具有一样的安全性和风险。
培养基的安全性，主要是指补充液的安全性，因为基础培养基的成份清晰和工业化量产的安全性容易把控。补充液的安全性本质上就是血清或血小板的安全性。 首先，欧盟和美国FDA从来没有明文规定不能用血清来培养各种细胞，只是要求保障血清的安全，即不含威胁生命健康的各种病原微生物，尤其是病毒。 欧盟的规定 欧盟2013年有文件《Guideline on the use of bovine serum in the manufacture of human biological medicinal products》规定胎牛血清供应方需要提供安全性检测，关键是不能污染了各种病毒（bluetongue and related orbiviruses、bovineadenovirus、bovine parvovirus、bovinerespiratory syncytial virus、bovine viral、diarrhoea virus、rabies virus、reovirus 3、bovine viral、bovine polyoma virus等）。最近对为GVHD生产和制备MSC细胞的欧洲中心进行的一项调查显示，依然有23%%的中心使用胎牛血清来培养MSC，这就明确了欧盟对MSC的培养规定并不排斥胎牛血清[2]。 美国FDA的规定 和欧盟的态度一样，美国FDA并不反对胎牛血清的应用。比如对病毒疫苗的生产就需要用到胎牛血清，FDA官网是这样描述的：“Viral vaccines are produced in living cells, which, similarly, require the addition of complex growth media components, such as fetal calf serum.” fetal calf serum指的就是胎牛血清。但FDA对胎牛血清的描述就没有欧盟那么具体，只需要保证胎牛血清不能来自疫区，明确提及不能污染口蹄疫病毒和疯牛病病毒。 2016年一个大规模的MSC验证实验[3]，涉及美国的7个GMP制备中心和1个研发中心，但是每个中心的制备工艺略有不同；其中六个制备中心使用胎牛血清（FBS，10%至20%），一个制备中心使用人血小板裂解物（HPL），一个中心使用无血清培养基；芯片检测的结果表明，同一制备中心的骨髓MSC批次之间的变异性小于不同制备中心的变异性。目前还不确定哪些制造因素导致了同一制备中心内部之间和不同制备中心之间的骨髓MSC变异性，可能导致的因素包括供者来源和制造方面的差异。 我国的《干细胞制剂质量控制和临床前研究指导原则》规定 “干细胞制剂制备所用的培养基成分应有足够的纯度并符合无菌、无致病微生物及内毒素的质量标准,残留的培养基对受者应无不良影响；在满足干细胞正常生长的情况下，不影响干细胞的生物学活性，即干细胞的“干性”及分化能力。在干细胞制剂制备过程中，应尽量避免使用抗生素。 若使用商业来源培养基，应选择有资质的生产商并由其提供培养基的组成成分资料及相关质量合格证明。必要时，应由专业检定机构对每批培养基进行质量检验，并出具检验报告。 除特殊情况外，应尽可能避免在干细胞培养过程中使用人源或动物源性血清，不得使用同种异体人血清或血浆。如必须使用动物血清，应确保其无特定动物源性病毒污染。严禁使用海绵体状脑病流行区来源的牛血清。 若培养基中含有人的血液成份，如白蛋白、转铁蛋白和各种细胞因子等，应明确其来源、批号、质量检定合格报告，并尽量采用国家已批准的可临床应用的产品。” 所以，因此，故而，只要把控好质量检测（致病微生物），血清的安全性问题是可以得到保障的。 （1）血小板（裂解物）的功能简介 血小板主要在其α颗粒中储存了多种生物活性介质，血小板的激活，伴随着这些多种生物活性介质的释放[4-8]，包括各种趋化因子和生长因子，如血小板衍生生长因子（PDGF-AA、-AB和-BB）、转化生长因子-β（TGF-β）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）、脑源性神经营养因子（BDNF）、血管内皮生长因子（VEGF）、表皮生长因子（EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、肝细胞生长因子（HGF）、结缔组织生长因子（CTGF）和骨形态发生蛋白（BMP）等等。因此，血小板可用作为原材料，以制备用于MSC扩增的生长因子制剂，适合于刺激骨髓MSC生长并维持其特性[9-12]。血小板裂解物适合各种人类组织中获得的MSC的培养扩增，并能维持这些细胞的免疫调节能力和分化能力[13-19]。 （2）血小板（裂解物）的培养功效和劣势 2005年首次报道人血小板裂解物（HPL）可以代替胎牛血清用于MSC的大规模培养和制备，能满足临床应用的需求[20]。随后有一系列的文章证明血小板裂解物能起到胎牛血清的功能，促进MSC的增殖扩增[1, 21]。脂肪和脐带来源的MSC，已被分离并用血小板裂解物进行扩增，提高了增殖潜能，同时降低了细胞胞体直径[22-26]。但另一些研究表明，用血小板裂解物培养的骨髓MSC的免疫调节活性和表面标记物降低[27-29]。也有专家认为在血小板裂解物中扩增的MSC的克隆形成效率和增殖能力表现得更好，而在胎牛血清中扩增的MSC更适合于预防/治疗免疫性疾病[30]。 因为血清的制备过程就伴随着血小板的激活，所有血清的营养价值远高于血小板裂解物。 由于血小板的α颗粒所含的细胞因子和生长因子的复杂性和异质性，因此血小板激活所释放的细胞因子和生长因子存在明显的个体化和制备批次之间的差异，导致最终产品的质量以及对细胞生物学和功能的影响有很大的不同[1, 31, 32]。也是因为这种批次之间的差异性，导致了不同研究所用的血小板裂解液的最佳浓度出现了显著的差异。比如，当MSC接种在羟基磷灰石-磷酸三钙（HA/TCP）生物材料上生长，5%的血小板裂解物对牙髓MSC的增殖有明显的促进作用，然而，血小板裂解物的浓度提高到10%时，却显著抑制MSC增殖[33]。另有研究显示任何浓度的血小板裂解物（1%-60%，大范围波动）促进脂肪MSC增殖的效果均优于10%的胎牛血清，而且20%血小板裂解物的效果最佳[34]。由于血小板裂解物的最佳使用浓度的明显差异，导致不能客观地比较不同研究小组之间培养的MSC质量差异。 有研究显示，由于生产模式和储存方式，血小板浓缩物被外来细菌污染的风险为0.1-0.6%，主要是由于静脉穿刺时供体手臂清洁不当[35-37]。改进的供体筛查，皮肤消毒和细菌筛查可以降低这种风险[38, 39]。 （3）血清的优劣 血清主要分人血清和动物血清（以胎牛血清为主）。血清的主要功能是提供各种营养物质，包括生长因子、激素、氨基酸、维生素、脂肪酸等，还有含有贴壁促进蛋白（例如fibronectin和vitronectin）以促进细胞黏附，以及激素和脂质，可以很好地支持MSC增殖和维持MSC的功能特性。与在添加胎牛血清的培养基相比，在无血清培养基培养的MSC显示出较弱的免疫抑制能力，前列腺素E2、吲哚胺2，3-双加氧酶和TGF-β1的表达明显下降[40]。由于血清提供的营养组分包含很多未知的物质，导致无动物衍生成分和化学定义的培养基尚未实现“突破性”进展，即不能完全取代血清的作用[41]。而且这些无血清培养基含有血清蛋白和细胞因子，所以仍然存在传播异种蛋白、感染、免疫的风险[42]。 与胎牛血清相比，人血清支持促进MSC的增殖，在较短的时间内实现了更多的MSC数量，而且还能延长MSC的传代次数[43, 44]。同时，人血清培养亦维持了MSC的分化潜能以及免疫调节功能[11, 43]。在人血清中培养的细胞比在胎牛血清中扩增的细胞更小，具有更多的纺锤形态，但人血清和胎牛血清培养的MSC的集落形成单位（CFU-f）频率和向成脂和成骨细胞的分化能力相似[43]。在人血清中培养的遗传/表观遗传变异少于添加胎牛血清的MSC培养中的遗传/表观遗传变异[9]。与胎牛血清相比，人AB血清的使用显著促进了MSC的增殖，并具有类似的免疫抑制作用[45, 46]。MSC不表达ABO血型抗原，因此使用胎牛血清培养MSC时，可以不用考虑血型的影响[47]。 当人类MSC在含有胎牛血清的培养基中培养时，这些蛋白中的一小部分保留在人类MSC的细胞质中，这可能在细胞回输到过敏体质的体内时引发免疫反应[48]。只有一项研究发现MSC输注后，在少数人体内能产生低浓度的抗胎牛血清IgG抗体[49]。更多的可能情况是没洗涤干净胎牛血清，在MSC注射液中存在，从而进入人体引起免疫反应。 当然，人血清也是有风险的，那就是传染人类致病微生物的风险，而且人血清所携带的致病微生物的种类比胎牛血清多得多[50]。也就是说，理论上人血清和血小板裂解液并不比胎牛血清安全，因为仍然存在着被常规献血者筛查未检测到的人类致病微生物的风险。 关于人血清，我国《干细胞制剂质量控制和临床前研究指导原则》规定，“除特殊情况外，应尽可能避免在干细胞培养过程中使用人源或动物源性血清，不得使用同种异体人血清或血浆。”因此，在我国不能合法合规地利用同种异体人血清来培养MSC。 可以预见得到的是，如果我国允许合法地利用同种异体人血清来培养MSC，随时细胞行业的大规模发展，人血清的需求量必定会大增，很可能会导致大量的卖血行为出现，艾滋病村的再一次出现也不是没有可能。而血小板的获取，同样来源于人血浆，同样面临着大量的卖血行为的出现。虽然宣传可以利用过期的血浆来制备血小板裂解液，但是我国普遍存在献血不足而临床对血量需求大的情况，利用血浆来制备培养细胞用的血小板裂解物，必定会加剧临床用血量的不足。 鼓吹血小板裂解物优于胎牛血清，是否带来大量血小板需求所导致的监管问题？ 基于我国对血制品的严格管理，并不允许血液的市场化私人买卖行为，所以我国的人血清和血小板裂解物的需求，基本上从国外的供应商采购，所以鼓吹用血小板裂解物代替胎牛血清，最大的利益方就是国外的这些供应商。那么，这些供应商是否在背后推广血小板裂解物（血替产品）代替胎牛血清的观念？ |
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