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按照GMP和质量标准进行细胞的高水平生产，需要一个完全封闭、可控制和可扩展的培养系统[1]。基于生物反应器的细胞扩展满足这些要求。生物反应器可以被定义为一个培养系统，其中对培养变量（如pH、温度、氧气和二氧化碳浓度）进行适当的监控和控制，以维持细胞的均匀物理化学环境，并在需要时提供粘附表面以支持细胞粘附（例如加入微载体）。虽然MSC可以在培养中扩增超过40个分裂周期（群体倍增，PD），但已经有专家建议最好是少于20个PD，尤其是是骨髓MSC，以避免可能的细胞转化[2, 3]。整个MSC规模化培养体系，核心在于培养基和培养模式的选择。培养模式还需要考虑MSC大规模扩增后的回收操作是否便利和符合GMP/GTP要求。 1，MSC培养基 大规模体外培养扩增高质量的MSC，是干细胞企业所追求的。那么建立合适的培养体系就显得非常重要，而培养基是重中之重。本公众号的文章《干细胞行业的葵花宝典：MSC的培养方法总汇》在MSC培养方面有专业详细的阐述。本部分内容有部分的重复和新的补充。（1）人源化培养基 用于分离和扩增MSC的常规培养基通常是确定的基础培养基DMEM添加10%-20%的胎牛血清（FBS）。然而，对于临床使用的FBS存在担忧：即（1）不同批次的FBS的可变性，（2）其定义不明确的性质，以及（3）FBS含有有害污染物的可能性，如朊病毒、病毒和人畜共患病试剂。当人类MSC在含有动物蛋白的培养基中培养时，这些蛋白中的相当一部分保留在人类MSC的细胞质中，这可能在细胞移植到体内时引发免疫反应[4]。更多的可能情况是胎牛血清没洗涤干净，在MSC注射液中存在，从而进入人体引起免疫反应。正因为如此，尽管FBS仍然广泛用于MSC研究，但成份清晰确定的无血清培养基，将是未来的发展方向。大多数MSC培养通常使用胎牛血清（FBS）作为培养基的补充。然而，为了避免传播异种传染病和免疫的风险，FBS的替代品有人血清、富血小板血浆和血小板裂解物（HPL）。人血清和血小板衍生物可以作为FBS的合适替代品用于培养人各个组织来源的MSC[5-10]。尽管已有报道称人类自体血清支持MSC扩增，同一个个体来源的血清，很难获得足够数量的这种血清来产生临床相关数量的MSC。同种异体人AB血清将绕过这个问题，因为几个捐赠者血清可以汇集在一起，以消除捐赠者特异性差异，并以大规模的方式生产[11]。人血小板裂解物（HPL）或富含血小板的血浆对MSC具有相当大的促进生长特性，同时保持其分化潜能和免疫调节特性[7, 8]。然而，一项研究报告称，尽管HPL支持MSC的扩增，但它也损害了其免疫调节能力[12]。此外，在HPL扩增的MSC中观察到成骨或成脂分化潜能的降低[13, 14]。理论上，人血清和血小板裂解液并不比FBS安全，因为仍然存在着被常规献血者筛查未检测到的人体病原体污染的风险。此外，人血清和血小板裂解液的生产制备的批次间的差异很大，它们维持MSC生长和治疗潜力的能力可能存在很大的差异，这可能会阻碍有质量保证的MSC用于大型临床研究的发展。因此，应努力使这些材料的生产标准化，限制供体与供体之间的可变性，在注重检测的基础上建立病原体灭活方法[15, 16]。需要注意的是，血小板裂解液在培养MSC的安全性和有效性方面并不一定优于胎牛血清，详情请见本公众号文章《血小板裂解物真的能代替胎牛血清？》（2）定义清晰的无血清培养基 化学成份清晰的无血清培养基进行MSC扩增[17, 18]，有利于减少人源和动物源的病原体污染的风险。有两种商业无血清培养基被证明支持MSC的分离和扩增，Mesencult-XF和BD Mosaic™。Mesencult-XF来源于加拿大的Stemcell Technologies公司，BD Mosaic™来源于美国BD公司。FDA批准的第一个商业无异种培养基是StemPro MSC-SFM（Invitgen）[19, 20]。在传代早期，脂肪MSC和骨髓MSC在MesenCult-XF中显示出比α-MEM（含血清）更好的增殖；然而，在MesenCult-XF中CFU明显较低，而且骨髓MSC在MesenCult-XF传代后期出现形态学改变，伴随着快速衰老（β-半乳糖苷酶活性增强）[21]。同样，早期GE-Healthcare公司开发的无血清培养基Xuri在促进骨髓MSC增殖和CFU-F克隆方面不如α-MEM（含血清）培养基[22]。脂肪MSC在STK2（一种化学定义的培养基，韩国Abion公司）中的增殖率明显高于在DMEM/FBS中的增殖率，在STK2中培养的MSC衰老速率降低，细胞体积小而均匀，并且遗传稳定性更高，与增殖/迁移、抗炎和分化相关的因子的表达增加[18]。无动物源和无血清的NutriStem培养基（以色列的Biological Industries公司），培养脂肪MSC，在第7天时，MSC分泌的HGF和Angpt-1高于单纯用低糖DMEM培养的MSC，但是VEGF和PEDF的分泌不如低糖DMEM培养的MSC[23]。从人骨髓、脐带、牙髓和脂肪中分离和培养的MSC经过ABCell生物公司的无血清培养基SPE-IV培养，不同来源的MSC在活性、CFU-F克隆形成和增殖方面没有差别[24]。牙髓来源的MSC在三种不同的培养基中培养，即StemPro-MSC/SFM-xenoFree（Life Technologies）、StemMacs-MSC/XF（Miltenyi Biotek），以及α-MEM完全培养基（Life Technologies）（含15%胎牛血清），α-MEM完全培养基培养牙髓MSC至P6-7代时，衰老的MSC（SA-β-Gal阳性）约10%，而无血清培养基StemMacs和StemPro培养的衰老MSC分别为30%和20%[25]。和含血清的完全培养基相比，无血清培养基PRIME-XV®（美国Irvine Scientific公司）培养的MSC的抗凋亡能力很差，对H2O2和紫外线的细胞毒性刺激更敏感[26]。目前的无血清培养可以做到低代数的情况实现大规模培养MSC。无血清培养基实现了MSC在数量上的大规模扩增，但是伴随着快速衰老和细胞质量的下降。MSC临床应用治疗疾病，不仅要强度MSC的剂量，而且还要重视MSC的质量。化学成份清晰明确的SF/XF培养基配方可能代表MSC的临床级生产的未来，但是，本小编认为血清或血小板裂解液依然是不可替代的。详情请见本公众号文章《MSC的无血清培养是趋势，但不是现在》。2，培养模式 （1）平面贴壁和球形培养 MSC的贴壁培养可能改变其表型和治疗特性，因为它代表的环境与它们在体内的小生境不同[27]。事实上，用生物因素或培养条件预处理MSC可以增强MSC的治疗功效[28-31]。一种方法是将MSC培养为球体[27]。MSC的聚集增强了它们的抗炎特性，即TSG-6和stanniocalcin-1的表达增加[32]。球体培养表达高水平的三种抗癌蛋白：白细胞介素-24，肿瘤坏死因子α相关凋亡诱导配体和CD82[32]。MSC聚集体的形成不仅可以增强细胞的抗炎特性，并且经过肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ处理的MSC，它们抑制巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子-α的能力得到增强[33]。（2）常氧和低氧培养 MSC的体外扩增通常是在正常的氧气（21%）水平下进行的。据报道，长期暴露于这些水平的MSC会导致DNA损伤，导致细胞衰老和治疗效果降低[34]。当在生理氧气水平（1-5%）培养MSC时，观察到细胞增殖速度以及其成脂和成骨分化能力的增加[35]。在低氧条件下扩增的MSC具有较低水平的氧化应激、DNA损伤、端粒缩短和染色体异常[34]，而且因迁移能力增强和生存能力提高而具有较高的治疗能力[36-38]。为了模拟缺血的微环境，将用血清培养的MSC置于缺氧条件下的无血清培养基中，发现其分泌的促血管生成因子水平增加，包括VEGF-A、血管生成素、IGF-1和HGF[39]。因此，鉴于这些观察结果，可能有必要考虑在体内移植细胞之前在缺氧条件下扩增MSC，以提高其存活率和治疗潜力。（3）微载体的选择 微载体通常是在材料、密度、直径和表面电荷方面不同的球形珠子。选择合适的微载体是MSC培养扩增过程的关键变量，因为它可以影响生长动力学以及扩增细胞的表型。微载体可以具有不同的表面性质和涂层，从而影响细胞附着和随后的细胞增殖。理想的微载体不仅应该能够支持有效的细胞附着和生长，而且应该能够在不损失MSC特性的情况下允许容易的细胞收获操作。一般而言，微载体表面覆盖胶原涂层，有利于MSC的细胞粘附和增殖。大孔和可生物降解的微载体已经被评估用于MSC的生长[40-42]。选择特定的最佳微载体的一种有趣的方法是使用能够评估单个微载体的性能并基于特定培养参数(细胞生长、群体倍增、收获效率)进行比较的小规模系统[43]。理想情况下，在经过至少3个重复的严格筛选方案后，可以围绕特定的微载体建立一个生产体系[44]。这些微载体允许细胞在微载体内部生长，不受搅拌生物反应器中存在的流体动力剪切的影响。通过使用可生物降解的微载体，MSC回收率可能更高。MSC甚至可以和微载体在体内局部移植而无需分离[45]。正如在无动物源血清培养基一样，无动物组分的微载体的使用也很重要。有些研究已经证明无动物成份的微载体能很好地支持人MSC的生长[20, 46, 47]。微载体密度和细胞数量比是众所周知的变量，不仅影响初始细胞附着效率，而且还影响细胞培养的密度水平。常用的微载体密度为2g/L，可以获得MSC的浓度在(1-4)×105细胞/毫升的范围[20, 40, 47]。在MSC增殖扩增的后期，需要注意添加足够的新鲜培养以补充细胞所需的营养。（4）大规模培养 单层培养即平面二维培养是传统的和广泛使用的MSC实验室扩增技术，对于小规模的实验需求来说，具有成本低和易于处理的优势。在这个基础上，一个大的培养瓶内，放置多层培养平面，即形成多层细胞工厂，Nunc和Corning公司都有商业提供。该培养系统旨在通过增加单个堆叠单元（培养平面）的数量来为细胞生长提供较大的表面。据报道10层的细胞工厂容器中可以实现(0.45-2.5)×108的MSC细胞的生产[9]。4个10层这样的细胞工厂，可获得10亿个MSC细胞，但是需要一个自动化细胞工厂操纵器（automated cell factory manipulator，ACFM）和一个大的培养箱[48]。尽管在促进MSC培养扩增方面有效，但单层培养技术有许多限制，包括连续传代的酶处理而可能干扰细胞功能特性的过度操作，以及由于频繁操作而导致更高的污染风险，缺乏对培养参数和细胞生理学的控制，用于产生足够数量的细胞需要长时间的培养。大量证据表明，单层平面（2D系统）培养损害了MSC的效力，而立体式（3D培养）培养可以通过增强MSC的抗炎能力、促血管生成能力、MSC的干性和存活率来增加MSC的治疗潜力[49, 50]。此外，单层培养瓶被认为是“开放系统”，因为它们的接种、培养基交换和细胞收获是通过操作员直接操作[51]。自动化和机器人技术可以最大限度地减少上面列出的缺点[52]。实验室中使用最广泛的生物反应器是组织培养瓶。然而，临床应用中需要大量的MSC，那在生产过程中将需要大量的组织培养瓶。处理大量的这些培养瓶是非常劳动密集型的，增加细菌污染的机会，而且往往会导致培养瓶之间的差异。考虑到MSC的应用需要一定量的剂量，有可能需要在生物反应器系统（培养扩增）中产生大量细胞，并创建一个强大的细胞库来为所有疗法提供MSC细胞[53]。因此，为了给临床提供大量的MSC，可以采用大规模培养的生物反应器，包括多层细胞工厂、滚筒瓶、中空纤维、填料床和搅拌悬浮生物反应器等。每个生物反应器都有其特定的特点，比较不同的生物反应器并选择最佳的生物反应器对于大规模生产有质量保证的MSC非常重要。比如，滚筒瓶已用于MSC组织工程应用和扩展[54]。虽然滚筒瓶代表着一个开放的系统和密集的劳动力，但与传统培养瓶相比，它提供了更大的表面积，并降低了对培养基的要求[1]。尽管该系统与静态培养瓶相比具有优势，但也有实验室利用滚筒瓶培养脐带MSC，即使优化不同的培养条件，使用滚筒瓶依然无法实现令人满意的MSC培养扩增[9]。关于立体式大规模培养的阐述和信息，请参见本公众号的文章《渐行渐近的MSC的3D培养》。3，培养的MSC的收获 MSC下游处理（DSP）涉及几个复杂的步骤，在细胞从支架或者微载体分离后，离心浓缩体积减小，多次细胞洗涤，以及低温保存。为了获得具有足够数量和功能的高纯细胞产品，整个DSP工艺必须满足特定要求，包括缩短处理时间、大量减少体积、高效洗涤（将杂质水平降低到<1ppm）、低剪切应力条件，整个系统还需要在GMP标准下封闭、自动化和可扩展性[55]。在基于微载体的培养中，收获细胞过程是一个必不可少的步骤，因为细胞将是最终产物。通常，与细胞粘附一起的微载体可以用蛋白水解酶处理，然后通过过滤分离细胞与微载体。胰蛋白酶、Tryple™、Accutase™、Alfazyme、Collagenase和TrypZean™是可用于从微载体分离MSC的酶。整个细胞收获的过程受多种变量的影响，包括酶类型和培养参数（浓度，温度和持续时间），静态系统和动态系统（搅拌系统的剪切力在脱离后降低细胞活力），以及细胞恢复后的下游过程（额外的步骤也会降低细胞活力）[56]。有实验室建议在适当的酶（胰蛋白酶）存在下短时间（7分钟）的强烈搅拌，MSC收获效率>95%；而且只需微调酶浓度和搅拌/时间，即可用于不同的细胞系和微载体[57]。事实上，大多数发表的文章都没有提到MSC的收获效率。孔径大于75μm的聚丙烯过滤器可以提供有效的微载体去除，孔径大于0.45μm（中空纤维盒）的聚砜膜能够将细胞浓缩到10倍（存活率>80%）[58]。使用负模膨胀床吸附（EBA）层析和基于核壳微珠技术的新型多模态原型基质，改进洗涤步骤，色谱步骤实现了单程操作，使活性和功能性MSC的回收率提高10倍以上，达到70%[59]。在浓缩和洗涤步骤之后，然后使用特定的低温保存缓冲液来低温冻存MSC细胞。可以使用自动化系统（如Crystal®PX）进行大规模的小瓶灌装，并且每批还需要控制速率冰柜来处理数千个小瓶，使细胞产品质量得以保持[55]。4，小结 每个干细胞公司/企业的MSC整个培养（生产）体系，都应该经过QbD（质量源于设计）设计和验证，做好细胞产品的CMC（Chemical Manufacturing and Control），才符合干细胞药品申报的规范要求。当然，每家干细胞公司/企业都有自己独特的细胞生产工艺的细节，只要终端产品（MSC注射液）符合国家的相关管理规定即可。需要注意的是，MSC的整个培养过程中，质量控制需要贯穿在整个工艺中，包括样本的采集和最后的注射液产品，检测重点详见本公众号的文章《间充质干细胞制剂的安全性分析和质控要点》。
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