 人间充质干细胞（human mesenchymal stem cells, hMSCs）由于其再生和免疫调节特性，以及能够迁移到损伤的确切部位，在现代治疗和再生医学中发挥着重要的作用；这些特性使hMSCs成为目前在开发创新细胞治疗产品中具有前景的活性细胞之一，已应用在糖尿病、烧伤、骨关节炎、移植物抗宿主病等特定疾病治疗上。 目前，全球基于hMSC的细胞治疗产品有500多项正进行临床试验，以评估其安全性和副作用，确定其剂量和给药途径，并检视其作为特定疾病的疗效。然而，只有8种基于hMSC的产品获得了上市营销。 鉴于近年来hMSC临床试验数量的快速增长和这些产品的复杂性，以及它们的细胞组分特征和药物产品状态，需要更严格、更具体、更统一地要求定义hMSCs的质量，并加强其安全性和有效性的分析。这些质控管理与分析应在整个制造过程中实施，以确保hMSC的功能和完整性，并保证每批次生产始终符合规范。因此，正确设计生产制造过程对于授权hMSC产品上市至关重要，最终产品的质量、安全性和有效性可以得到保证，然后才能作为医疗產品在人体内使用。   hMSC的产品制造过程包括不同阶段：供者选择和评估（异基因疗法）、血清学检测、活检、分离、生物样品处理，必要时通过体外扩增获得预期的细胞数量，中间产品和最终产品的鉴定、包装和放行(下图)。hMSC产品制造过程需符合GMP生产规范。GMP确保hMSC产品始终按照质量标准制造和管控，同时将细胞制造过程中被传染源污染的风险降到最低。除了质量控制程序和风险评估，其他制造方法应与设施一起到位和验证，如体外扩增过程、清洁、环境监测、运输、材料消毒、培养液填充等。操作人员尤其需要经过严格训练，以获得操作资质。因此标准化操作程序与环境是非常必要的。 hMSC的产品制造过程 供者选择与血清学检测 hMSC产品制造过程的第一步是选择供者（异基因产品），然后通过供体测试来检查生物起始材料，包括自体和异基因hMSC产品。每位捐赠者必须接受体格检查，以排除传染病的迹象或症状。此外，还应进行血清学研究，至少检测人类免疫缺陷病毒（1型和2型）、肝炎病毒（B型和C型）和梅毒螺旋体。美国FDA还要求排除一些相关疾病，如西尼罗河病毒(West Nile Virus)、败血症(sepsis)和痘苗 (vaccinia)。 在大多情况下，hMSC产品的临床应用涉及大量细胞的给药剂量。骨髓、脐带和脂肪组织是常见的获取hMSCs的组织来源。然而，hMSCs的分离技术因细胞来源的不同而不同。因此，有必要开发有效的hMSC分离和体外扩增方法，以获得预期的细胞数量。常见分离hMSCs的方法，包括组织块贴壁法、红细胞溶解法和梯度密度法。骨髓来源的干细胞通常被视为金标准。然而从骨髓或脐血中获得的hMSCs的百分比相对低，因此通过微创方法获得脂肪组织，再经过密度梯度离心分离MSC是目前值得注意、简单而经济的方法，以提高hMSCs的产量。 但为獲得可供给药劑量，分离后的hMSCs必须经过体外大规模扩增。而体外扩增过程涉及对hMSCs的实质性操作，这可能对细胞的生物特性、生理功能和结构特性进行重要的改变，因此是hMSC产品生产过程中一关键階段。以往使用胎牛血清(FBS)培养hMSCs，因含有潜在风险，如人畜共患传染源、微生物污染物和免疫反应，目前已避免使用；朝无血清细胞培养（serum-free cell culture）(StemMACS MSC Expansion Media Kit XF, 130-104-182) 方向发展。无血清条件下用以扩增hMSC的人血小板裂解物（human platelet lysate, hPL）可通过全血来源的血小板浓缩物或经阳性红细胞抗体筛选后的血小板分离法获得。人类血液病原体（如病毒、细菌、真菌和朊病毒）的传播风险可在hPL生产过程中进行病毒灭活处理，以确保最佳安全性。因此，人血小板裂解物（hPL）可作为FBS的替代品用于临床级别的细胞治疗。 通过标准化和一致性的方法，定义、监测和质量管控每个hMSC产品中存在的细胞成分，以确保最终产品的质量、安全和有效性。因此评估hMSC细胞特性、活性、纯度、潜能、扩增能力、基因稳定性、致瘤性与疗效是基本条件。此外，依据GMP规范，在体外扩增过程中，细胞应该受到监控分析产品是否受到污染。为确保hMSC的产品在制造过程中不会受到感染，hMSCs在分离阶段、参考样品（reference sample）、中间产物、最终产物、保留样品（retention sample）、种子细胞库（master cell bank）和工作细胞库 (working cell bank)等均需执行质量管控。
临床级hMSC生产过程质量管控 hMSC细胞冻存 hMSC可以新鲜使用，或在同种异体治疗情况下可将细胞冻存备日后使用；目前超过三分之一的hMSC临床试验使用冷冻保存的细胞。因此，诸如冷冻保存（cryopreservation）和解冻（defrosting）方法、最大冻存时间和激活细胞的过程是至关重要的，均须在制造过程中进行验证和界定。 低温保存技术(cryopreservation technique)是基于称为低温保护剂（cryoprotective agents，CPA）小分子进入细胞，防止细胞内形成冰晶与抵抗降温过程产生的渗透压力，来保存细胞。hMSCs最常用的冻存液是以DMSO降低冻结点(freezing point)以及动物血清或无动物成分的冻存液（StemMACS™ Cryo-Brew, 130-109-558），以在缓慢冻存过程中（1-2.5°C/min）保存hMSCs的功能和活性。此外，冻存hMSCs的细胞密度也取决于下游的应用。大多数临床方案建议静脉注射100-200x104 cells/kg，或皮下或心肌内注射1.2-6x108 细胞。因此，hMSCs通常被冷冻在浓度为200-2500x104 cells/ml、总体积为1ml的冷冻管中。 hMSC终产品需依据制造的剂量表和给药途径分为初级包装（如袋或注射器）和次级包装（如标签、盒子、传单）。 在这一阶段，应进行稳定性测试，评估和确定最终产品在整个储存和运输过程中的最佳储存条件，以保持其完整功能不变。终产品由hMSCs、赋形剂、其他类型的细胞，甚至与医疗器械结合而成。稳定性测试可以计算hMSC终产品的保质期，可以储存hMSC终产品的最长时间，在给患者使用之前保持其特性。  hMSC产品放行 hMSC产品制造过程的最后阶段是根据产品规范中定义的要求放行产品。产品规格表需准确地描述hMSC产品必须满足的验收标准、分析技术和分析方法。细胞特性、活性、纯度、潜能、增殖能力、基因组稳定性和微生物检测均须在hMSC终产品规格表中明确标示。一旦获得所有结果，就可进行最终放行。 在最终产品放行之前，应将大量等分样品冷冻保存（保留样品），作为再分析的备用，供管理存储和发送hMSC产品。最后这些阶段也必须加以控制，以确保良好分销规范 (Good Distribution Practices, GDP)。 现今hMSCs应用受到许多临床前和临床研究，评估其安全性和疗效以用于不同的疾病上的治疗。然而他们的作用机制、最大剂量、以及理想的给药途径、以及何为准确的质量控制以及何时必须进行质量控制仍是需要解决的问题。因为这些因素将影响hMSC产品的价格，从而影响其在市场上的可及性。因此，基于hMSC的临床产品生產製造过程的开发是一个不断发展的领域。 为帮助鉴定人间充质干细胞，国际细胞治疗学会（ISCT）在2006年提出了三个最低标准：
Relevant markers in MSC Phenotyping Kit, human (130-125-285)
参考文献: Principal Criteria for Evaluating the Quality, Safety and Efficacy of hMSC-Based Products in Clinical Practice: Current Approaches and Challenges. Pharmaceutics. 2019 Oct;11(11). pii: E552. doi: 10.3390/pharmaceutics11110552. 美天旎中国 在看点这里 |
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