微生物细胞为宿主的DNA转移方法

     将连接有所需目的DNA片段的载体转入宿主细胞的方法因宿主细胞种类和DNA分子大小的不同而不同，常见的以微生物细胞为宿主的DNA转移方法主要有以下几种。

(1)感受态转化法转化是细胞吸收游离DNA的过程。一般而言，只有感受态细胞才能率地吸收外界的DNA。转化是用质粒作载体所常用的导入方法。对大肠杆菌，zui常用的感受态细胞制备方法是CaCl2(或RbCl)法，该方法简便易行，其转化效率虽不很高，但足以满足一般实验的要求，且制备的感受态细胞在一70℃下可保存较长时间，因此使用广泛。CaCl2法制备感受态细胞的大致流程。

    将感受态菌体与重组DNA分子混合物，在42℃水浴中热激处理数分钟，然后放回冰水浴中保持半小时，就可完成转化。CaCl2法的关键是要处理对数生长期的细胞，并尽量保持低温操作。

    CaCl2法外，大肠杆菌感受态的制备方法还有Hanahan法和Inoue法等，这些方法制备的感受态的转化效率均远高于CaCl2法．但由于操作比较麻烦，所用试剂也较不常见，故反而不如CaCl2法使用普遍。

    有些细菌可以自然生成感受态，利用转化来转移DNA就比较方便。酵母也可以采用醋酸锂法实现转化，但须用单链DNA。对于无法诱导感受态或无法自然生成感受态的细胞，就必须采用其他DNA转移方式。

(2)原生质体转化法通常完整细胞只有在感受态下才能吸收外源DNA。对于难以得到感受态细胞的微生物，一种替代的方法是采用PEG介导的原生质体转化法。一些杆菌、链霉菌、酵母和霉菌等的转化经常采用该方法。

(3)高压电穿孔转化法 电穿孔是一种电场介导的细胞膜可渗透化处理技术。电穿孔的机理仍不清楚，一般认为，受体细胞在电场脉冲的作用下，细胞壁上形成一些微孔通道，使得DNA分子直接与裸露的细胞膜脂双层接触，并引发吸收过程。不同的细胞电穿孔的操作条件也不同。以大肠杆菌为例，一般调节电脉冲为25μF，电压2．5kV，电阻200Ω，作用时间约为4．6ms。大肠杆菌100kb以上的大质粒的转化一般都采用电穿孔转化法。由于多数微生物都可以找到合适的电穿孔条件，因此该方法适用面很广。

(4)接合转化法 接合是指细菌细胞之间的直接接触导致DNA从一个细胞转移至另一个细胞的过程。这个过程是由接合型质粒完成的，它通常具有促进供体细胞和受体细胞有效接触的接合功能以及诱导DNA分子传递的转移功能，两者均由接合型质粒上的有关基因编码。在DNA重组中常用的绝大多数载体质粒缺少接合功能区，因此不能直接通过细胞接合方法转化受体细胞。因此首先将具有接台功能的辅助质粒转移至含有重组质粒的细胞中，然而将这种供体细胞与难以用上述转化方法转化的受体细胞进行混合．促使两者发生接合作用，zui终导致重组质粒进入受体细胞。这种方法的标准实验流程需要混合三种菌株：含接合型辅助质粒的菌株、供体菌和受体菌。其基因转移过程：接合型辅助质粒首先转移到供体菌，然后再协助供体菌中的含目的基因的质粒转移到受体菌中。这样的过程一般称为三亲杂交。

(5)噬菌体转导法 以λ—DNA为载体的重组DNA分子，由于其相对分子质量较大，通常采用转染的方法将其导入受体细胞内。在转染之前必须对重组DNA分子进行人工体外包装，使之成为具有感染活力的噬菌体颗粒。用于体外包装的蛋白质可以直接从大肠杆菌的溶源菌中制备，现已商品化。这些包装蛋白通常被分成独立放置且功能互补的两部分：一部分缺少E组分；另一部分缺少D组分。包装时，只有当这两部分的包装蛋白与重组λ—DNA分子三者混合后，包装才能有效进行。重组DNA分子zui后通过转导引入受体菌。