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随着CAR-T产品在国内的上市，今年也被称为是中国的CAR-T元年，可以预见不久的将来陆续将会有更多的免疫细胞治疗产品上市。然而，作为比CAR-T研究更早的细胞产品，间充质干细胞产品上市的形势却依然不太明朗。 同样的情况也发生在美国，美国食品药品监督管理局（FDA）至今没有批准过一款真正意义上的间充质干细胞产品（下文简称MSC产品）上市。目前处在临床研究阶段、离获批上市比较接近的是Mesoblast公司的Remestemcel-L，它是一款骨髓来源、可用于异体移植的MSC产品。适应症为儿科患者SR-aGVHD，在2020年提交了NDA申请。依据Mesoblast披露的数据，在其3期临床试验中，28天OR达70%，100天OS达75%。但是FDA还是提出了一些担忧，包括临床有效性的证据不充分、产品有效性检测指标与临床效果关联性不强等。 MSC产品走向上市，药学研究是基础，稳定成熟的生产工艺则是实现细胞治疗产品成为药品这一转化过程中的关键要素。以下四个工艺开发中的难点，是笔者认为的、目前影响MSC产品通向成功上市大道上的四大拦路虎。作为饲养细胞所不可或缺的“饲料”，培养基及其添加物组成的培养体系，在细胞治疗产品的生产中，属于最重要的原料。它就相当于燃料对于火箭、芯片对于计算机来说一样的重要。目前MSC培养基可以分为如下五类（TABLE 1），基础培养基加5%或10%胎牛血清是常见的培养体系，研究表明，αMEM或DMEM/F12较适合于MSC的培养，低糖的环境更加接近生理环境，也更利于维持MSC的特性。胎牛血清中含有丰富的生长因子及贴壁因子，一些研究者通过外源添加一些生长因子来降低对FBS的依赖，例如EGF、FGF、PDGF等。但是，由于FBS来源于动物，存在着动物病毒传播的风险。同时，输注后，也可能存在病人对异种蛋白产生免疫反应的风险。虽然目前美国、欧盟等国家未禁止FBS的使用，但作为原材料，应对其建立严格的质控，尤其是避免引入TSE/BSE（海绵状脑病）风险。血小板裂解物（下文简称hPL）被认为是一种能有效的替代FBS用于MSC培养的添加剂，其含有丰富的营养因子。基础培养基添加5%或10% hPL也能稳定的规模化扩大生产MSC。2018年一项针对欧盟血液和骨髓移植中心的调研发现：77%的中心在MSC培养中使用了hPL，剩余23%中心使用了FBS，表明hPL已经成为目前MSC培养的主流添加物。然而，hPL也并非完美无缺的，它同样存在着一些不足。目前市面上商品化的hPL来自人源，由于成分复杂，且不同批次间hPL的原料来源不同，因此会造成不同批次间的hPL成分存在较大差异，从而导致添加不同批次hPL的培养体系、用来培养同一来源MSC产品会存在批间差异。 因此，使用无异源、仅添加一些蛋白和生长因子的化学成分限定培养基（chemicaldefined medium，下文简称CDM培养基）是近些年来国内细胞治疗行业的主流共识。所谓CDM培养基是指培养基中的素有成分都是明确的，不含动物蛋白、不添加植物水解物，而是使用一些已知结构与功能的小分子化合物。比如短肽、植物激素等。这类培养基以前一般用于诱导培养细胞分泌产物，从而进行产物分析。CDM培养基或许是将来细胞治疗产品首选的培养体系，因为相对而言，其成分明确，而且更加安全。但是在现阶段，从培养效果上来看，在细胞增殖率和细胞表型稳定性两个指标方面，CDM培养体系都不如含动物蛋白（如胎牛血清或hPL）、成分相对不明确的培养体系。国内现在已有专门供应细胞治疗产品的培养基品牌和生产厂家，其商品化的培养基基本能满足细胞治疗产品规模化生产过程中稳定及批间差异性小的生产需求，但同时也都存在一些有待改进提升的问题：首先，出于避免配方泄露的考虑，培养基厂家通常不会提供具体成分。因此，无法得知其是否添加了某些血清来源的蛋白、是否来源可控。其次，大多数无血清培养基都需要做包被处理，这对于科研类的细胞培养或许适用，但对于规模化生产的细胞产品，就难以适用了。此外，某些免包被的CDM培养基，用于组织培养以诱导原代细胞增殖的效果并不佳，通常需要在无血清培养基的基础上添加低浓度的hPL才能达到较好的培养效果。传统的MSC培养通常使用培养瓶作为培养容器，但受容器底面积的限制，其扩增效率并不高，如将其应用于大规模生产，相应的生产成本将非常高昂（场地、人力、培养箱及培养瓶的投入将非常巨大），且生产过程中的质量风险和质量监控难度也随之增加。使用更大表面积的细胞工厂可以对工艺直接简单的放大，从而提升生产效率。但是，2D培养存在其本身的局限性：一方面，受限于表面积体积比，其放大的规模依然有限，且操作的污染风险高。另一方面，其细胞代谢无法监控，只能通过预期的培养周期和细胞形态观察来判断细胞的状态，现在越来越多的研究关注培养过程中细胞的代谢。与培养方式相关的另一个问题是自动化与封闭式的规模生产如何实现。通过蠕动泵挤压硅胶管或者C-Flex管实现液体转移的方式，在传统生物制品生产中经常被应用。MSC产品不同于前者之处是多了一个消化过程，需要实现对洗涤液、消化液等多种液体的转移来收获细胞，这无疑增加了操作的复杂程度和质量监控难度。目前，MSC产品规模生产实现全过程的自动化和封闭式还比较困难， 从2D到3D培养方式的升级是解决上述问题的关键。由于MSC的贴壁培养特性，3D培养需要借助于一些载体完成贴壁。如微载体，贴附于微载体上的MSC可以实现悬浮培养，利用生物反应器逐级线性放大。也有一些不借助微载体的生物反应器，如通过2D培养方式的中空纤维柱。其可以实现全自动、封闭式地培养和收集细胞，且具有代谢可监测、收集体积小等优势，是一种取代细胞工厂的理想规模化生产方式。但3D培养同样也存在一些技术难点，例如细胞在微载体上的贴壁及生长不均一、细胞回收率偏低、细胞与微载体不易分离等，这还需要相关产品的研发部门进行进一步的优化改进。不论是2D还是3D培养方式，其下游收集、浓缩、洗涤、灌装过程目前还都是难点。传统的浓缩方式是利用离心管和离心力分离细胞与上清，当规模放大后，这种浓缩方式的缺点就暴露出来：需要使用多个离心管并进行开放式操作。由于MSC产品属于非最终灭菌产品，因此按GMP要求，为降低生产过程中的质量风险，需配置B+A的操作环境，或是使用隔离器。但不管是哪种方式，都将提高最终制剂的生产成本，同时降低生产效率。而如果不采用前面两种硬件配置，则会增加MSC产品生产过程的质量风险。此外，MSC在收集过程中，较高离心力和大量细胞的相互挤压会对细胞造成机械损伤，而使用连续流技术收集细胞能彻底解决大体积样本浓缩的问题。目前有基于切向离心、膜过滤、逆流离心原理的洗涤浓缩设备，可以一次性处理10-20L体积的细胞悬液。使用连续流技术收集细胞的方式相对传统的离心收集方法而言更加温和，可提升收获的细胞回收率及活力。唯一的缺点，就是由于该技术目前普及度不高，所以其设备和一次性耗材成本高昂，使用的话将增加设备和耗材的直接投入成本。
冻存细胞及细胞终制剂使用人手工分装的方式难规避过程中引入污染的质量风险，因此很难符合现行法规和监管要求。而解决的办法，是使用自动或半自动灌装方式加封闭式的冻存容器。
大规模灌装工艺需考虑的问题是细胞的混匀，细胞颗粒在静置条件下由于重力作用会发生沉降，导致细胞颗粒中在细胞悬液中分布不均。而灌装的速度也是影响到MSC产品质量的关键技术要点。由于预冻存的MSC产品一般都会添加冻存保护剂，以避免在降温过程中形成大冰晶破坏细胞膜及细胞器。而目前主流的冻存保护剂都含有二甲基亚砜（DMSO），DMSO在常温状态下（10℃以上）会对细胞的膜质产生损伤，时间越长损伤越大。因此，预冻存MSC产品悬液的灌装时间不宜过长、灌装速度不宜过慢。目前市面上有一些自动或半自动的灌装设备可以解决上述问题，但使用这些设备同样存在的问题是价格昂贵。可适用于液氮冻存条件下的封闭容器有冻存袋、封闭式冻存管以及冻存瓶，但该类容器均需配套相应的灌装设备，以实现大规模生产过程中收获MSC产品的快速灌装。 总体而言，相较于传统生物制品，MSC产品的下游处理工艺成本更高，需要综合考虑成本、监管政策等选择合适的下游工艺来进行整合。MSC产品的关键质量属性包括细胞鉴定、纯度、生物学活性及安全性，由于MSC是活细胞药物，不同于化药及其他生物制品，其生物学作用是多靶点、多通路的。机制复杂，主要活性指标归类为诱导分化能力、免疫调控能力和组织再生能力。不同的临床适应症、生物学活性指标不同，通常需要先明确临床作用机制，在此基础上开发代表生物学活性的检测方法。国外目前一些已上市的MSC产品，针对不同适应症，其生物学活性指标要求并不相同。例如Prochymal(Temcell)是一款针对GVHD适应症的MSC产品，通过测量细胞可溶性TNFR1的水平作为生物学活性指标。而Stempeucel是一款针对严重肢体缺血和急性心肌埂塞的MSC产品，则是通过测量细胞上清液中VEGF水平作为细胞生物学活性指标。 因此，由于机制的复杂性，开发合适的生物学活性指标存在如下难点：首先，需要确定是否能找到合适的、与临床作用机制关联的体外检测指标，并且检测方法简单可行、稳定性高，不受其它不可控因素差异的影响而产生结果差异。其次，需要确定其是否可作为批次放行的质量控制点标准。第三，需要探究检测指标与临床效果是否具有相关性且相关性较高，检测结果好的批次产品是否临床效果好，应通过大量临床试验去证实。 以上仅是列举了一部分影响MSC产品通向上市获批的难点，一个新的化学药品从基础研究到获批上市路途遥远、长路漫漫，一般至少要十年。就更别说是具有生物活性、能自我复制、自我更新的细胞产品了。但是，笔者仍然十分期待，作为当今国际先进药品监管权威和风向标的美国FDA，能尽快批准一款真正意义上的MSC产品上市，从而激励并促进中国国内监管机构和行业上下游企业，联合推动MSC产品上下游工艺难点的加速攻关突破，进而提升国内MSC产品的质量，同时降低生产成本，促成MSC产品的早日上市，最终让患者受益。PS：本文中观点仅代表笔者个人观点，不代表任何公司和机构的决策与判断。如因笔者水平有限而造成某些误解，在此先表致歉！- SotiropoulouPA, Perez SA, Salagianni M,Baxevanis CN, Papamichail M. Characterization of theoptimal culture conditionsfor clinical scale production of human mesenchymalstem cells. Stem Cells. 2006Feb;24(2):462-71.
- TrentoC, Bernardo ME, Nagler A, Kuçi S,Bornhäuser M, Köhl U, Strunk D, Galleu A,Sanchez-Guijo F, Gaipa G, Introna M,Bukauskas A, Le Blanc K, Apperley J,Roelofs H, Van Campenhout A, Beguin Y,Kuball J, Lazzari L, Avanzini MA, FibbeW, Chabannon C, Bonini C, Dazzi F.Manufacturing Mesenchymal Stromal Cells forthe Treatment of Graft-versus-HostDisease: A Survey among Centers Affiliatedwith the European Society for Bloodand Marrow Transplantation. Biol BloodMarrow Transplant. 2018 Nov;24(11):2365-2370.
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