文献分享——白血病细胞中过表达yamanaka四因子导致细胞凋亡

目录

前言1. OSKM因子可以减少体内白血病细胞数目2. OSKM四因子对正常造血细胞影响不大3. OSKM增高不会引起免疫细胞的杀伤4. OSKM增高导致AML细胞凋亡5. OSKM增高改变白血病细胞的染色质可及性6. Sox2和Klf4解释了白血病细胞的死亡7. H3K9甲基化抑制剂可以选择性抑制白血病细胞后记

前言

今天分享来自NC的一篇工作：

Targeting of apoptosis gene loci by reprogramming factors leads to selective eradication of leukemia cells

URL：https://www./articles/s41467-019-13411-y

我们知道Yamanaka四因子可以诱导成纤维体细胞脱分化，重编程成为诱导干细胞。

于是有人做了实验，想把白血病细胞也用Yamanaka四因子诱导重编程成为诱导干细胞，结果意外发现白血病细胞全部死了，而正常HSPC细胞却完好无损。下面我们来看看这个工作到底做了些什么，又有哪些神奇的发现！

1. OSKM因子可以减少体内白血病细胞数目

1. 为了重编程白血病细胞，作者首先使用了实验室里的一种细胞系——MLL-AF9-OSKM。

2. MLL-AF9-OSKM细胞特性：

• MLL-AF9融合基因整合在细胞基因组上，所以这是一种白血病细胞

• OSKM四因子受到tetO基因的promoter驱动，只有在受到外界Dox刺激时，tetO基因表达时会同时诱导OSKM四因子的表达。

1. 作者将MLL-AF9-OSKM细胞微静脉注射到经过辐照后的C57小鼠体内。当体内MLL-AF9-OSKM细胞生长数目占到骨髓10–15，40–60或90%时，开始给小鼠喂含有Dox的水，诱导OSKM四因子的表达。

1. 这时出现了神奇的结果：通过喂带有Dox的水，诱导OSKM四因子表达的小鼠，即使只用Dox处理了7天，在停止诱导OSKM四因子表达后1年内，小鼠仍有存活，而且肿瘤在骨髓中负荷越低，则其生存的概率越大。而没有诱导OSKM四因子表达的小鼠，则在20天内全部死亡。

1. 之前在成纤维体细胞中表达OSKM四因子，诱导脱分化为iPSC，小鼠很可能会形成畸胎瘤。但是在MLL-AF9细胞中诱导表达OSKM四因子，却没有形成畸胎瘤。

2. 在其他AML小鼠模型中，用相同的方法表达OSKM四因子，出现相似的结果。

1. 因为在MLL-AF9细胞上加有GFP荧光标签，所以我们可以用流式去分析细胞数目的动态改变：随着使用Dox诱导表达OSKM四因子，MLL-AF9细胞数目逐渐减少，基本上1周之内骨髓或者脾脏中的MLL-AF9细胞全部消失。

1. 同样，作者使用双光子成像检测了小鼠活体中MLL-AF9细胞的分布：

1. 以上结果共同说明了，在白血病细胞MLL-AF9细胞中表达OSKM四因子并不会将其诱导脱分化为iPSC细胞，反而会杀死这些白血病细胞。

2. 进一步分析，因为在小鼠实验中，诱导OSKM四因子表达后，小鼠一年之内均可以存活，不会复发产生AML，说明很可能OSKM四因子的表达杀死了白血病干细胞LSC。

3. 为了验证在白血病细胞中过表达OSKM四因子后是否可以杀死白血病干细胞，作者设计了不同的实验：

• 收集不同时间点下用药和不用药诱导OSKM四因子的GFP细胞，在体外进行CFU实验，发现诱导OSKM四因子表达的白血病GFP细胞产生克隆的能力减弱甚至完全消失。

• 流式统计LSC细胞数：对于LSC细胞的marker定义IL7Rα-Lin−cKit+Sca1−。可以看到，在下图中，在过表达OSKM四因子的细胞中，LSC细胞比例明显低于不表达OSKM四因子的细胞。

• 极限稀释实验：加入Dox诱导OSKM四因子表达的细胞中，LSC细胞数目明显更低。

小结：

1. 这部分实验结果，首先证明了小鼠模型中真的成功过表达OSKM四因子。

2. 然后对过表达OSKM四因子的细胞在小鼠体内的表型进行分析，发现过表达OSKM四因子的白血病细胞致病性明显减弱。

3. 探索原因：发现MLL-AF9细胞总数减少。进一步分析发现白血病LSC细胞也明显减少。

结论：在白血病细胞中过表达OSKM四因子，可以减少白血病细胞数，尤其是对LSC细胞的杀伤。

2. OSKM四因子对正常造血细胞影响不大

1. 既然表达OSKM四因子可以对白血病产生杀伤作用，那么这4个因子对于正常造血细胞会有什么反应呢？作者于是接下来开始探索OSKM四因子对于正常造血细胞的影响。

2. 为了回答这个问题，作者设计了如下实验：将带不同荧光、同时过表达OSKM四因子的细胞等比例混合后一起移植到小鼠体内，等到小鼠骨髓中MLL-AF9白血病细胞比例达到20%和50%时，开始使用Dox诱导7天。

1. 同样的，先确定模型是否可靠。作者检查了正常造血细胞以及MLL-AF9白血病细胞中OSKM四因子的表达量。发现OSKM四因子在白血病细胞中的表达量高于HSPC细胞（LKS+），但是却低于HPC细胞（LKS-）。

1. 移植后，小鼠的生存情况和前面的结果一致：不加Dox诱导表达OSKM四因子，则小鼠很快死亡。在小鼠白血病细胞负荷越轻的时候开始使用Dox诱导表达OSKM四因子，则小鼠的生存越好。并且分析在使用Dox诱导表达OSKM四因子后，不同时间节点下受体鼠中，供体小鼠白血病细胞（绿色）和正常HSPC细胞（红色）的比例关系。可以看到在表达OSKM四因子后，正常造血细胞明显处于优势，占据了绝大部分的细胞比例。

1. 上面的实验证明了：同时在白血病细胞和正常BM细胞中过表达OSKM四因子，相对于白血病细胞，正常BM细胞没有受到抑制性的影响。但是此时，我们仍然不知道：和正常不过表达OSKM四因子的BM细胞相比，过表达OSKM四因子的BM细胞到底有什么影响。于是作者又进一步设计实验：

个人感觉：“将CD45.1正常BM细胞”和“CD45.2过表达OSKM四因子的正常BM细胞”的细胞移植到经过辐照的CD45.1细胞体内后，如果在Dox处理前，先对受体小鼠体内CD45.1和CD45.2细胞比例进行测定，结果应该会更好。

1. 可以看到：

• 在后面用Dox处理后，CD45.2细胞的比例没有发生什么改变，说明过表达OSKM四因子的正常BM细胞与正常BM细胞在增殖能力上没有显著差异：

• 并且BM细胞的分化潜能也没有太大改变：

• 关键是：过表达OSKM四因子后，HSPC以及HPC细胞数目也没有像白血病细胞一样减少：

• 在经过7天Dox诱导过表达OSKM四因子后，和正常不过表达OSKM四因子的BM细胞相比，过表达OSKM四因子后，BM细胞的增值分化潜能没有明显改变！

• 既然最开始我们的目的是想看OSKM四因子对于重编程的作用，作者这里也看了下在不同细胞中OSKM四因子重编程的效率：HPC和HSPC的重编程效率最高，不过这也可能是因为他们本身就有较高的分化潜能。而GMP这种更下游的细胞则重编程效率稍低。至于LSC则效率最低。

1. 同样的，作者还在其他系统（脐带血+THP1白血病细胞系）上做了验证，得到了同样的结果：

小结：

1. 这部分实验结果，首先证明了过表达OSKM四因子的白血病细胞和过表达OSKM四因子的正常骨髓细胞相比，过表达OSKM四因子的正常骨髓细胞不会表现出被抑制的情况。

2. 进一步与正常骨髓细胞相比较，分析发现过表达OSKM四因子的正常骨髓细胞和不表达达OSKM四因子的正常骨髓细胞在增值能力、分化潜能上没有显著差异。

结论：在正常骨髓造血细胞中过表达OSKM四因子，对骨髓细胞没有显著影响。

3. OSKM增高不会引起免疫细胞的杀伤

1. 接下来探索到底是什么因素引起了白血病细胞的死亡。于是先做了microarray进行mRNA分析：将MLL-AF9-OSKM cells移植到小鼠体内，等到在BM中长到50%时开始用Dox处理诱导OSKM四因子的表达。收集Dox处理 2+3天 以及用水处理 2+3天 的MLL-AF9-OSKM细胞，芯片测序后对差异基因进行富集分析：

• 可以看到，与没有过表达OSKM四因子的白血病细胞相比，过表达OSKM四因子的白血病细胞富集了很多关于免疫相关的通路。这个结果提示免疫细胞可能在导致白血病细胞死亡上有一定作用。

1. 为了验证过表达OSKM四因子白血病细胞的减少是否和免疫细胞有关，于是作者将过表达OSKM四因子的白血病细胞移植到经过辐照后免疫功能缺陷NOD小鼠（缺乏T、B细胞，但是有一定的NK细胞和巨噬细胞活性）体内。发现无论有没有NK细胞和巨噬细胞，在免疫功能缺陷NOD小鼠中，不经过Dox诱导OSKM四因子的小鼠全部死亡，而约80%经过Dox诱导OSKM四因子的小鼠存活。这些结果说明了，Dox诱导OSKM四因子的小鼠存活不是因为免疫细胞对白血病细胞的攻击所致。

• 抗CD122抗体可以阻断T细胞和NK细胞的分化。

• clodronate liposome药物可以去除巨噬细胞。

小结：

• 在这部分内容中，作者尝试从转录组去探索在过表达OSKM的白血病细胞中，到底发生了什么，使得细胞数目大量减少。

• 根据对mRNA的分析，对差异基因进行GO富集分析，找打了许多与免疫细胞相关的信号。为了验证过表达OSKM白血病细胞数目的减少是否与免疫反应有关，作者用小鼠实验进行验证，发现过表达OSKM白血病细胞数目的减少与小鼠体内的免疫反应无关。

4. OSKM增高导致AML细胞凋亡

1. 前面体内样本mRNA分析发现免疫功能有异常，但是体内实验验证后发现与体内样本mRNA分析结果相违背。那么是不是因为体内有一些无法控制的混杂因素影响了结果呢？所以作者干脆直接体外诱导OSKM在MLL-AF9细胞中过表达，然后直接分析体外细胞样本mRMA的变化。

2. 根据上面mRNA数据的分析结果，发现在过表达OSKM四因子后2-3天会出现免疫反应。那么是什么引起了免疫反应呢？在更早期的时候，发生了什么呢？于是作者在MLL-AF9白血病细胞中，分析了过表达OSKM四因子后0、3、6、12和24h样本，同时做了没有过表达OSKM四因子的MLL-AF9白血病细胞。他们的聚类热图如下：

• 两个生物学重复聚类时可以聚在一起，说明样本数据质量好，可信度高

• 过表达OSKM四因子后3h样本和没有过表达OSKM四因子的MLL-AF9白血病细胞聚类在一起，说明过表达OSKM四因子后3h样本转录组变化不大，而到了6h后才发生剧烈变化。

1. 作者接下来在HSPC细胞（cKit+）中，分析了过表达OSKM四因子后0、3、6、12和24h样本，同时做了没有过表达OSKM四因子的HSPC细胞（cKit+）。他们的聚类热图如下：

• 两个生物学重复聚类时可以聚在一起，说明样本数据质量好，可信度高

• 过表达OSKM四因子后3h及6h样本和没有过表达OSKM四因子的细胞聚类在一起，说明过表达OSKM四因子后3-6h样本转录组变化不大，而到了12h后才发生剧烈变化

上述结果表明，癌细胞和非癌细胞对过表达OSKM四因子的反应，发生在不同的时间点上

1. 归根到底，OSKM都是转录因子，那么作者就将注意力放在了OSKM转录因子可能的下游靶基因上。于是作者在所有差异基因中，找出是OSKM转录因子下游的靶基因，并对这些基因进行GO富集分析：

• Top20的通路中，有免疫细胞相关信号，不过前面实验已经证明了与免疫细胞无关

• Top20的通路中，有细胞凋亡以及细胞死亡的相关信号，作者后面将注意力放在细胞凋亡上，因为这个信号可以解释为什么白血病细胞死亡了

• 在细胞凋亡以及细胞死亡相关信号中，在过表达OSKM后的白血病细胞中其信号随着Dox的诱导越来越强；而在过表达OSKM后的cKit+细胞中其信号随着Dox的诱导先变强，后开始下降

1. 细胞死亡的原因有2种：细胞凋亡+细胞坏死。那么过表达OSKM后的白血病细胞是哪种死亡形式呢？于是作者从细胞表面marker+细胞形态学改变同时判断细胞死亡的模式：

• 从细胞表面marker判断，过表达OSKM四因子后的白血病细胞凋亡逐渐增多↑

• 从细胞形态学改变判断，过表达OSKM后没有细胞坏死的形态学改变↑

1. 接下来作者又从蛋白层面去验证，对几个细胞凋亡过程中比较重要的蛋白：TP53，PUMA，Caspase-3等在过表达OSKM四因子的白血病MLL-AF9中进行wb实验验证表达情况：发现与细胞凋亡相关的蛋白都明显升高，说明细胞内凋亡程序的确已经启动。

1. 看完了MLL-AF9-OSKM的细胞，那么在正常cKit+细胞中过表达OSKM四因子后是否同样发生了凋亡呢？实验发现在正常cKit+细胞中过表达OSKM四因子后并没有明显的凋亡情况出现。

1. 至此，我们可以推断出：过表达OSKM四因子的MLL-AF9会出现凋亡增加，从而导致细胞死亡增多；而在正常cKit+细胞中过表达OSKM四因子则不会引起凋亡增加。

2. 为了进一步观察在过表达OSKM四因子的MLL-AF9细胞中凋亡的动态变化过程，作者使用一种指示剂——C3AI，该蛋白可以被 caspase-3蛋白酶水解，从而改变C3AI蛋白结构，使剩下蛋白发出天蓝色荧光（CFP）。所以我们可以根据天蓝色荧光的强度来判断细胞凋亡的强烈程度。

3. 为了保证转染效率，作者用puromycin筛选带有C3AI的过表达OSKM四因子的MLL-AF9细胞。然后将带有C3AI的细胞分成2组，1组加Dox诱导OSKM四因子表达，1组则不用Dox处理。

• SYTO染色活细胞。可以看到+Dox诱导OSKM四因子表达后，活细胞数减少，同时C3AI表达增加，说明细胞凋亡增加。

• CFP+细胞表示发生细胞凋亡的细胞。可以看到发生凋亡的细胞数明显增加。

• +Dox诱导OSKM四因子表达后14h后，与不加Dox相比，凋亡开始显著增增加

小结：

• 这部分作者首先用mRNA的数据，对不同时间点样本进行聚类分析，发现过表达OSKM四因子6h后，白血病细胞转录组发生剧烈改变。而cKit+细胞中在过表达OSKM四因子12h后细胞的转录组才发生剧烈改变。

• 考虑到OSKM都是转录因子，于是作者在差异基因中挑选出作为OSKM下游调控的差异基因进行GO富集分析，找到了与细胞凋亡和细胞死亡相关的term。

• 细胞死亡有2种方式，细胞凋亡和细胞坏死，接下来作者从形态学、细胞marker、凋亡相关蛋白wb同时证明了在白血病细胞中发生的是细胞凋亡，而在正常cKit+细胞中则没有出现细胞凋亡的活动。

• 最后作者动态监控了过表达OSKM四因子后，白血病细胞出现细胞凋亡的动态改变。发现诱导OSKM四因子表达后14h后，白血病细胞中的凋亡活动开始显著增加。

5. OSKM增高改变白血病细胞的染色质可及性

1. 作者做到这里没有停下，而是继续深挖，是什么导致了细胞凋亡的开始？

2. 考虑到这些都是转录因子，并且其中Oct4，Sox2和Klf4还是先锋转录因子。尽管c-Myc不是先锋转录因子，但是其可以促进OSK与染色质的结合。在yamanaka的实验中，通过OSKM四因子引起的重编程过程中：谱系特异性转录因子位点的染色质状态从开放变为关闭，随后在多能性基因位点从封闭变为开放。那么同样的，在肿瘤细胞中过表达OSKM四因子后，是否会发生同样的过程呢？白血病细胞的染色质可及性是否发生了改变呢？

3. 作者对 过表达OSKM四因子的MLL-AF9白血病细胞 及 过表达OSKM四因子的cKit+细胞 在用Dox处理后的0，3，6，12和24h样本进行ATAC-seq分析。然后找出差异开放区域（FDR < 0.05）：

• 如果开放程度增加，则称为：closed to open (CO) 区

• 如果开放程度减弱，则称为：open to closed (OC) 区

1. 过表达OSKM四因子的MLL-AF9白血病细胞 及 过表达OSKM四因子的cKit+细胞 在用Dox处理后的0，3，6，12和24h样本的差异ATAC-seq结果如下：

• 在过表达OSKM四因子的cKit+细胞中，直到Dox处理后12h染色质可及性才出现明显改变；而过表达OSKM四因子的MLL-AF9细胞中则表现相反，大多数改变都是由关闭变成开放的区域（CO区域），并且由开放变成了关闭（OC区域）从12h后才开始明显增多。并且变化程度比在过表达OSKM四因子的cKit+细胞中高25-400倍。

• 在过表达OSKM四因子的cKit+细胞中，Dox处理后12-24h后有更多的区域由开放变成了关闭（OC区域），这其中很多是造血特异谱系相关的转录因子（例如PU.1 和 Myb）↓

• 在过表达OSKM四因子的cKit+细胞中，Dox处理后12-24h后由关闭变成开放的区域（CO区域）只有Oct4，而不包含Sox2，Klf4以及Nanog 这些多能性位点↓

1. 为了解析生物学改变，作者对这些差异开放区域进行注释。好巧不巧，在白血病细胞的ATAC-seq差异开放区域中又看到了细胞死亡信号，而在正常cKit+细胞中却没有这个信号的改变：

小结：

• 作者这部分主要在从染色质可及性上去解释为什么白血病细胞发生了细胞凋亡。

• 通过ATAC-seq的数据，作者发现诱导OSKM四因子过表达后，正常细胞或者白血病细胞中造血谱系特异性的位点都由开放变成了关闭。

• 对差异区域进行注释后，发现在白血病细胞中，调控细胞死亡的通路开放状态越来越强，这和前面mRNA的结果不谋而合。而在cKit+细胞中则没有这种改变。

6. Sox2和Klf4解释了白血病细胞的死亡

1. 前面的实验证明了过表达OSKM四因子后，在白血病细胞中染色质的可及性的确发生了改变，那么这些改变是什么因子引起的呢？是某个转录因子发挥关键作用还是其中某些转录因子组合发挥作用呢？还是说OSKM四因子一个都不能少呢？

2. 于是作者对过表达OSKM四因子的白血病细胞进行分析，在差异染色质开放区域富集其中的motif。结果发现：可以富集到ETS、RUNT、Sox以及Klf家族的转录因子，但是对于Oct4只能在正常cKit+细胞中富集，同时c-Myc则完全无法被富集。而根据报道，c-Myc的过表达会导致细胞凋亡，而在这里的ATAC-seq分析中，我们却没能富集到c-Myc的motif，这进一步让我们怀疑：杀死白血病细胞的作用到底是哪些因子在发挥作用？

1. 想要回答上面的问题，最简单的方法当然是单独去看每个因子的作用，作者也的确是这样做的。作者取出cKit+细胞及白血病MLL-AF9细胞，并单独转入表达Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc的质粒。因为在ATAC-seq结果中只富集到Sox以及Klf，所以作者后面还加了一种同时转入Sox和Klf质粒。

• 在白血病细胞中：转入c-Myc或者Oct4的细胞，其细胞生长情况和control之间没有差异，而单独转入Sox2、Klf4或者同时转入Sox2和Klf4的细胞则细胞数明显减少。

• 在正常cKit+细胞中：单独转入表达Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc质粒的细胞，其细胞生长情况和control之间没有差异，同时转入Sox2和Klf4的细胞与control之间同样没有差异。

1. 接下来作者同样检测了这些细胞的细胞凋亡情况以及克隆形成能力，可以发现与前面类似的结论：单独转入Sox2、Klf4或者同时转入Sox2和Klf4的细胞，其细胞凋亡增多，且克隆形成能力减弱。

小结：

• 作者这部分主要分析了OSKM四因子中到底是哪些因子对于杀伤白血病细胞发挥重要作用。

• 通过单独将四因子分别转入白血病细胞以及正常cKit+细胞中，观测细胞的生长情况及细胞凋亡情况，发现四因子中Sox2和Klf4这2个因子发挥重要作用。

7. H3K9甲基化抑制剂可以选择性抑制白血病细胞

1. 做到这里，机制上虽然不能说非常清晰了，但是也算有些头绪了，最起码知道由于染色质可及性的改变引起了细胞凋亡，并且四因子中Sox2和Klf4这2个因子发挥重要作用。

2. 我们知道组蛋白的修饰与染色质可及性之间关系密切，而只知道染色质可及性发生改变并不能解决实际问题，毕竟染色质可及性只是个概念，没法落实到具体的分子上。所以作者从组蛋白修饰上去找切入点。作者分析在Dox诱导不同时间点下，不同组蛋白的变化：发现只有H3K9me3在白血病细胞中下调，而在正常cKit+细胞中没有变化。

1. 对于H3K9me3在白血病细胞中下调的结果很快吸引了作者的注意力，因为在同时转入Sox2和Klf4这2个因子后，MLL-AF9白血病细胞中也同样出现了结论：

1. 蛋白层面表现一样，那么功能上是否也是一样的呢？于是作者找到一个小分子药物——chaetocin。chaetocin可以特异性抑制H3K9的甲基化：

• 使用chaetocin处理没有过表达OSKM四因子的MLL-AF9白血病细胞，发现可以使白血病细胞出现相同的细胞表型——细胞数减少，尤其是当chaetocin浓度为30nM时。而在正常cKit+细胞中则没有太明显改变：

• 使用chaetocin处理没有过表达OSKM四因子的MLL-AF9白血病细胞，发现可以使白血病细胞出现相同的细胞表型——细胞凋亡增加，尤其是当chaetocin浓度为30nM时。而在正常cKit+细胞中则没有太明显改变：

• 使用chaetocin处理没有过表达OSKM四因子的MLL-AF9白血病细胞，发现可以使白血病细胞出现细胞开始分化。而在正常cKit+细胞中表现为克隆形成能力轻微减弱：

1. 除了细胞系外，作者还拿临床患者的AML细胞以及正常CD34+骨髓细胞进行实验处理，用chaetocin对细胞进行处理后发现有相同的表型改变：白血病细胞数减少，细胞凋亡比例增加。而正常CD34+骨髓细胞则细胞数无显著改变，细胞凋亡增加不明显。

1. 找到可能是H3K9甲基化引起的改变，那么作者接下来就去在转录组数据中，看了看前面差异分析的结果中是否有可以催化H3K9甲基化的几个甲基转移酶和去甲基化转移酶。找到了加Dox处理后明显升高的组蛋白去甲基化酶Kdm3a和加Dox处理后明显降低的催化H3K9甲基化的Suv39h1/Suv39h2。

• 但是可以看到，在Dox处理后3h，MLL-AF9的组蛋白去甲基化酶Kdm3a开始升高，这个趋势和wb的结果在时间上是一致的；而催化H3K9甲基化的Suv39h1/Suv39h2则在第12h才开始降低，而wb结果中，在Dox处理后3h H3K9me3的甲基化逐渐已经被去除。

1. 根据时间的一致性，作者将注意力放在了组蛋白去甲基化酶Kdm3a上。于是作者分别用qPCR验证了在Dox处理后白血病细胞中Kdm3a表达量逐渐增高，而正常HSPC细胞中Kdm3a的表达量则没有明显升高趋势。

1. 接下来作者在过表达OSKM的MLL-AF9白血病细胞中敲除Kdm3a后，白血病细胞的细胞凋亡减少：

1. 而在正常HSPC细胞中过表达Kdm3a后，HSPC细胞开始出现细胞凋亡：

小结：

• 作者这部分从组蛋白修饰上，找到了H3K9me3在在白血病细胞中下调，并用小分子药物chaetocin在没有过表达OSKM四因子的白血病细胞中抑制H3K9的甲基化，得到了与之前实验完全相同的细胞表型。

• 找到H3K9me3下调后，作者又通过转录组数据找到了引起这一切改变的去甲基化酶Kdm3a，并通过敲出及过表达验证了Kdm3a的作用。

后记

个人觉得这个工作挺好的，读的时候给我一种CNS主刊的感觉，但是却发到了NC上，有些许可惜。

不过，大家需要从从这篇工作用学习下整个文章的逻辑思路，算是一环扣一环，环环紧扣。