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2021年3月15日晚上7点半，在安必平爱病理平台上，来自河北省肿瘤医院的刘月平老师及四川大学华西医院的张璋老师，围绕乳腺癌HER2 FISH检测，为我们带来了一场丰富多彩的学术讲座。 刘月平老师：《乳腺癌HER2规范化病理检测及进展》 首先，刘老师谈了HER2检测临床与病理的关系：1）所有初诊为浸润性乳腺癌的患者，都要进行HER2检测；2）只要能获得肿瘤组织，对复发灶和转移灶都应进行HER2检测；3）临床医生和病理医师都应注意HER2检测结果是否与组织病理学特征相符，下列组织学类型通常为HER2阴性：组织学分级为一级的浸润性导管癌、经典型浸润性小叶癌、小管癌、粘液癌、筛状癌、伴髓样特征分化的癌、分泌性癌、低级别腺鳞癌、腺样囊性癌等。这些肿瘤如HER2检测结果为阳性，则视为检测结果和组织病理学特征不符合，需要核实或重新诊断。 刘老师指出，中国2019版HER2检测指南是基于国内的临床证据和循证医学依据，对病理和临床都有重要的指导意义。本版指南在IHC判读上的变化主要是2 的判读标准变化，及对染色模式的定义的变化。
在FISH判读上，中国2019版与美国ASCO/CAP2018版有所不同：
对于第2组的判读，在上一版指南中该组的判读为阳性；但BCIRG 006临床试验数据显示，该部分患者并未从曲妥珠单抗治疗中获益。2018版的ASCO/CAP指南对于这部分患者需要结合免疫组化的结果进行分析，假如IHC判读为3 ，则可判为FISH阳性。但是，这部分患者在N9831临床试验数据中数目为0，且另一篇ASCO/CAP的文献上的临床数据中这部分患者的数目也是0。且综合考虑以下几个因素：当组织处理欠佳，会出现免疫组化假阳性病例HER2判读不准确，可能会有2 患者被判3 ；部分单位FISH报告医生和IHC报告医生不同，FISH医生不愿意承担IHC检测和判读的风险。综合以上因素，最后中国共识对于该组的样本，建议增加计数细胞，如果结果仍为比值大于等于2，平均拷贝数小于4，则直接判为阴性，不需要结合IHC结果。 第三组比值小于2，平均拷贝数大于等于6在上一版指南中为阳性。BCIRG 005的研究结果，该组患者DFC和OS都比较差。2018版ASCO/CAP指南对于这组也是需要结合IHC的结果。后来实验分析发现，对于这组患者，采用内对照不是CSP17探针的时候，基本上都变成了比值大于2，拷贝数大于6的情况。所以这组患者在中国指南的建议也是加大计数细胞后，如果结果维持不变则可直接判为阳性。 第四组在上一版指南中是定义为“不确定”的结果，但此结果对于临床实际上是不好接受的。所以这一版改成重新计数至少20个细胞，如果结果不变，则结合免疫组化结果进行综合分析。 新版指南对临床实践到底有什么影响呢，美国的MARTIN V教授用新标准对本中心的标本进行验证，得出的结论是新版指南更加的精准。而在临床数据里，用新版指南判读，阳性患者是降低了0.4%，阴性增加了8.2%，但MARTIN V认为新指南筛选出的阳性患者会对靶向药物治疗更加的有效。该指南也让微浸润癌HER2判读不再纠结。另外新指南把之前“不确定”的那组患者去掉，对于临床也是很大的帮助。 刘老师也提出了“HER2低表达”这一类型，低表达的定义为：HER2 IHC 1 /2 且ISH阴性。低表达患者的占比为45%-55%，占比还是挺大的。而最新数据显示，此类型患者中的部分患者也是受益于DS-8201药物的，所以这部分患者的准确检测也是很重要的。地方和中心实验室HER2评估的差异比较结果显示，最初IHC为0的患者，高达85%在中心实验室检测为1 和2 。这也就要求病理医生应该遵循新版HER2检测指南及保证IHC检测质量，以确保结果的准确性和可重复性。现在也有一些新技术，比如IHC信号放大、数字PCR、NGS等技术也会应用于HER2的检测，也是对有争议的结果有一个新的验证手段。另外，HER2除了扩增，也有可能出现插入突变等，与耐药相关。 最后，刘老师对整个讲座进行了三个总结：1）新版指南的颁布解决了HER2检测实际工作中的一些问题，为进一步提高HER2检测的准确性和可操作性提供了保证。2）有些问题有待于进一步完善，需要积累更多的循证医学依据。3）任何指南都不是一成不变的，需要不断累积和完善，为乳腺癌患者的诊治提供更有力的保障。 刘老师的讲课内容丰富而新颖，基于循证医学的证据又结合指南的变更，最后还分享了HER2检测的一些新技术新亮点，大家受益匪浅。 张璋老师：《乳腺癌HER2检测判读实践》 张老师提到新指南的更新，对于患者，病理医生，临床医生三方都有很大的帮助。对于患者而言：得到更为明确的病理结果，更明确的治疗方案；不确定病例诊断路径的优化，缩短报告周期；部分病例不再强制要求重新检测手术标本，减少了检测费用。对于病理医生而言：HER2诊断不仅要观察蛋白表达或基因扩增情况，更要综合考量标本质量、组织学形态以及临床表现；对于既往有争议的部分给出更为明确的判读标准和检测路径；对检测流程的规范性提出更高的要求。对于临床医生来说：HER2结果更加明确，减少了临床治疗选择的困惑，降低了医患沟通成本；更加强调了与病理医师保持紧密沟通和合作；对于标本的规范化前处理有更高的要求。 第一块讨论患者和样本。乳腺癌HER2检测的适宜人群包括：1，所有新诊断的浸润性乳腺癌（进行了IHC检测的穿刺组织，建议有条件手术切除标本再行检测，尤其浸润性癌HER2阴性病例）；2，所有复发或转移的乳腺癌病例应尽可能再次检测；3，新辅助化疗后仍有肿瘤残留的病例建议再次检测。而样本的类型为：手术切除标本；粗针穿刺活检标本；麦默通活检标本；大于100个癌细胞的细胞学标本。而经过冰冻处理的标本是不推荐的。 国内外的研究显示，活检与手术标本的一致性较高，活检与切除标本的HER2检测结果一致率在94.68%-98.8%，这个也是要基于良好的实验室质控。 提示HER2检测不一致性的组织学特征，其中包括原发浸润性乳腺癌粗针穿刺标本：手术切除标本中存在与穿刺标本形态学不一致的高级别浸润性癌成分、G3浸润性癌、浸润性癌成分少、IHC和ISH均显示HER2“不确定”状态、标本处理欠佳（如离体缺血时间长、固定时间短、不同的固定剂、检测技术）。此类样本如果显示HER2阴性，必须选择手术标本再行检测。另外原发性乳腺癌HER2检测结果为阴性，但疾病复发且生物学行为提示可能为HER2阳性肿瘤时，需考虑重复HER2检测。 新辅助化疗后，如果HER2状态发生改变，可能的原因是：1，治疗后细胞遗传学上出现基因表达的获得或缺失，染色体不稳定等。2，新辅助治疗前HER2检测多采用乳腺穿刺组织，取材有限，当存在HER2异质性时也会导致与新辅助治疗后手术标本检测结果的差异。 而对于转移灶和复发灶中是否需要再检测HER2，张老师指出：建议在转移性或复发性肿瘤中重复检测HER2状态；对于复发病灶，HER2重复检测对于确定真正复发还是第二原发也有帮助。 张老师又提到HER2在32-55%的DCIS（导管原位癌）中有过表达，在60-70%的高级别DCIS中有过表达。35.8% HER2阳性的DCIS中伴有浸润现象，而HER2阴性的病例中仅12.2%有浸润，因此HER2 IHC染色一定程度上能提示DCIS病例中浸润病灶的存在情况。这个结论也提示导管原位癌的HER2检测也是很有意义的。 而伴有浸润的DCIS：77%例DCIS成分与浸润癌成分HER2表达一致，22%例HER2表达不一致的病例均为DCIS成分HER2阳性而浸润癌成分HER2阴性，提示并非所有的浸润癌具有与原位癌一致的HER2状态，所以还是有必要进行进行HER2的检测。 对于微浸润癌的HER2检测，若IHC切片中能判断微浸润癌的HER2状态，应予以报告；若IHC切片中微浸润病灶过少，难以评估HER2状态可予以备注。FISH检测建议至少在2个代表性区域内计数≥20个浸润性癌细胞，细胞数量过少的微浸润灶不宜行FISH检测，告知患者FISH检测缺乏浸润性癌的可能性。 张老师说到自己医院华西医院的3795例HER2分组检测的一个数据，得出的结论是新版指南更利于临床医生的决策和指导。而影响HER2检测的结果也是与样本的及时及正确处理息息相关的，其中包括有：1）组织处理不佳会严重影响质量控制，张老师也建议临床在组织切开和固定的标准化操作，以及固定时间要保证在6-72小时。2）传统的脱钙剂（盐酸）会破坏DNA，也会影响FISH检测，建议使用一些新型的中性或偏碱性脱钙剂。 张老师也讨论了病理医生对HER2判读的影响因素。 张老师的阅片建议关键点为：1）IHC染色阳性对照和阴性对照（以不同染色强度的组织芯片作为对照为最佳外对照）。2）低倍镜下观察整张切片：是否存在异质性（需要IHC预判可能扩增的区域与FISH结合定位），然后观察外部对照和内部对照（淋巴细胞、血管内皮）是否为典型的2红2绿。但是由于切面原因，会导致正常组织的个别细胞非2红2绿，但是只要有>75%肿瘤细胞呈现双色信号即可。3）计数细胞必须有完整细胞核膜、DAPI染色均一、至少一个红色和绿色清晰信号，不能重叠。 而计数信号点的原则为：1）计数细胞必须有完整细胞核膜、至少有一个红色和绿色信号，不能重叠不计数小于平均大小的肿瘤细胞。2）需要连续计数（除外重叠细胞、单信号细胞和体积过小细胞），选择两个或更多的代表性区域，每个区域至少计数20个随机选取的连续性浸润癌细胞核的双色信号。不能专门挑选红色信号多的细胞去计数。3）观察信号时应随时调节荧光显微镜的焦距，记录位于细胞核不同平面上的信号，避免遗漏。4）有条件可以把片子保存1年以上（-20摄氏度保存），方便随时溯源。 然后张老师还结合科室的经验，建议在计数时要有一份原始记录的表格，写清楚每个计数细胞的红绿信号点，即便是簇状扩增也要写大概的信号点个数。这样不仅方便计算比值和平均拷贝数，也利于保存和回溯。 张老师还分享了部分科室遇到的HER2FISH判读的案例，包括有：1），17号染色体单体，导致比值大于2，但是按照新版指南，这个患者判为阴性。2），17号出现多体，比值小于2，但是红色平均拷贝数大于6，该患者判为阳性。3）本案例是红色和绿色都是出现明显的簇状扩增，虽然比值不大于2，但是红色已经簇状，可以判为阳性，从这个案例也引申出大部分所谓的17多体其实都是染色体着丝粒区段与HER2一同出现扩增，而并非染色体出现多条。4）本案例是旧指南判读是不确定的结果，综合IHC结果后，是个阴性结果。5）该案例是个异质性很明确的，异质性的定义：>10%浸润性癌中成群的细胞出现扩增，所以只要浸润性的癌巢区有大于10%的扩增区域，就可以判读为阳性了。张老师也强调了如果该区域的阳性细胞是散在分布的，是不能特意挑选信号多的去计数的，还是得需要连续的去计数。 最后张老师还展示了华西医院一份完整的报告模板。张老师的讲课运用自身判读经验，结合医院案例，以及大量临床数据的支持，全方位地讲解了HER2检测的方法、技巧和难点解析，是一堂不可多得的精彩课程。
提问讨论环节 在最后的提问环节中，不少老师也借此提出了一些专业性问题。我们挑选了下面几个问题及张老师的回答供大家参考。 对于阳性区域大于10%判为阳性以及至少数到20个细胞这两个概念，如何去解读，以及具体的判读方式？ 张老师：对于这种异质性的表现，会先找到明显扩增的热点区，然后在这个区域下进行计数，看这个区域的阳性细胞是否有连续性（计数20个细胞左右），如果阳性有连续性，而这个热点区域又占整个切片的10%以上，就可以判为阳性，但是如果不到10%，也会在报告上备注比例，但是判读为阴性。不过在实际遇到时，科室出于严谨，对于这种案例可能会换人加大计数量再综合去考量。 医院里HER2在免疫组化2 中，FISH阳性的比例大概占多少？ 张老师：之前也有发表过多中心的数据，大概是占20%，也有遇到过一些医院占比高达50%，但是去分析的时候发现，该医院是把免疫组化3 的也放进去2 的结果里，是想让患者都去做一下FISH检测，所以比例才偏高。 绿色信号有大有小，是不是代表绿色信号扩增了，会不会影响判读？ 张老师：绿色信号有大小点，不能说明绿色信号扩增，扩增与否还是得看数目有没有增多，可以先在正常的淋巴细胞、血管内皮细胞等观察绿色信号点是什么样的大小，如果是小于这个信号点的大小，就倾向于不计数，但是如果大于，就按照正常去计数。基于新版指南，其实最为关注的还是HER2的信号点，所以不需要害怕绿色大小点会影响判读。然后也有技术上的原因：1）着丝粒区段和HER2区段挨得很近，可能绿色点会与HER2以微体的状态一同扩增，造成绿点有大有小；2）着丝粒探针是重复DNA构成的，不同染色体的丰度不同，也可能是杂交效率较好造成的绿色探针与其他非17号染色体结合的非特异杂交信号点，所谓的小点可能是非特异信号点，这个通过加强洗涤可以去掉。 两个半小时的课程在认真而热烈的学习氛围中结束。HER2检测是FISH开展的最为成熟、占比最大的一个项目。其临床循证医学证据虽然最为丰富，但目前还有很多更为深入的研究及进展。两位老师的分享让大家更为全面的增长了知识，大家也一定能在工作中获益。感谢两位老师的精彩讲座，我们下期再见！ |
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