|
经常会碰到有人问我，什么是FISH技术？FISH技术是做什么的？这些红红绿绿的点是什么？是不是做了FISH就能诊断是不是癌症……，带着这些问题，我想尽量能够以一种最简单的回答来解决大家的困惑，尤其是初学者。 在分子检测技术层出不穷的今天，传统的观察病变组织或细胞形态，检测异常蛋白的表达或含量已经不能够满足临床诊疗需求，人们需要越来越多胞核内的DNA或RNA改变信息来了解疾病尤其是肿瘤或遗传疾病的发生机制、进展机制、耐药机制以及靶向药物作用的机制；在这里面，基于PCR平台的点突变、测序和基于原位杂交平台的FISH技术是大家使用较多的方法。 根据肿瘤或遗传疾病发生机制的不同、样本来源限制以及经济支付考虑，人们在选择检测方法时也有所不同。FISH技术一般用于了解基因或染色体发生扩增、缺失、融合或断裂；样本来源广泛：组织、脱落细胞、羊水、血液、骨髓都可以检测，且不仅限于新鲜样本，2-3年的石蜡样本都可以检测；FISH检测在分子检测里是收费最低的而且很多地方FISH检测都进入医保可报销范畴。 FISH(fluorescence in situ hybridization)即通过荧光素标记的DNA探针与样本细胞核内的DNA靶序列杂交，从而获得细胞核内染色体或基因状态的信息（如下图所示）
肿瘤或遗传疾病的机制的主要特征是克隆性染色体异常，它通常包括染色体或基因数目异常和结构异常，比如乳腺癌HER2基因数目扩增，又或者肺癌ALK基因的结构重排，要了解患者的染色体或基因是否发生这些改变可以指导用药或者辅助诊断。
目前通过FISH方法可以检测各条染色体的靶标接近300余种，能够满足临床上大部分肿瘤及遗传疾病的检测需求，这还不包括一些用于科研的罕见基因靶标。
目前主要用于指导靶向药物的使用如赫赛汀（HER2）、克唑替尼（ALK/ROS1/CMET）；用于诊断如淋巴瘤“双打击”（BCL2/BCL6/MYC），脑胶质瘤独特类型（1p19q）；用于危险分度如血液MDS（5/7/8/20染色体及XY）；用于产前筛查唐氏综合症（CSP21）。
基于形态基础的分子检测，可以更好的结合形态学为病理诊断提供准确信息，尤其是对于肿瘤异质性很强的样本，其他分子检测往往脱离形态基础，无法判断是否是肿瘤的细胞发生了异常。
肿瘤或遗传疾病的机制的主要特征是克隆性染色体异常，它通常包括染色体或基因数目异常和结构异常，比如乳腺癌HER2基因数目扩增，又或者肺癌ALK基因的结构重排，所以探针主要有计数探针和结构探针；检测的结果可以是扩增、缺失、融合、断裂。
通过标记一段特异性的DNA片段，或者是某条染色体特有或者是某个基因特有，由于正常人的染色体是二倍体，那么正常人的检测信号就是两个，当信号多于两个或者少于两个（排除切片影响），该染色体或者基因就异常（扩增或缺失）。
某基因发生重排时会在相对恒定位置断开，通过不同颜色荧光素标记断裂点两端特异性的DNA片段，该基因没有发生重排不同颜色（如红绿）靠近会发生混色形成其他颜色（如黄），如果发生断裂，则形成单独的颜色（如单独的红或绿），当然，结构探针同样能够提示数目异常（如多倍体）。
比对HE或IHC结果确认所要观察的区域 如果是数目探针，直接观察基因标记颜色进行计数确定数值或者平均拷贝数，根据不同探针说明书要求进行判断，比如乳腺癌HER2基因有明确的指南，先看比值，再看拷贝数，有一些则是直接看比值。 如果是结构探针，先要明确异常信号模式，然后再计数各种异常信号的细胞个数占观察区域总体细胞比例，再比对判读标准进行判断。
比对HE或IHC结果确认浸润癌的区域（注意不是原位癌），结果有以下几种可能：
a.计数20个细胞，HER2红绿比值大于2，且 HER2拷贝数大于6，点状扩增阳性 b.计数20个细胞，HER2信号成簇，绿色CSP17信号正常，直接判读簇状扩增 c.计数20个细胞，HER2信号丢失（单体），绿色CSP17信号丢失（单体），可能由于单体造成HER2信号缺失 d.有时候信号出现缺失，可能仅仅限于部分绿色CSP17，这样比值计算就失去意义，可能需要参考其他分析结果 e.有时候，一个样本可能混杂有正常、异常信号，以各种比例的混合，让我们难以下结论（阴性或阳性？） 比对HE或IHC结果确认肿瘤区域，结果有以下几种可能：
a.计数20个细胞，出现1红1绿1融合比例>15%，判读为阳性，如果比值接近15%，需要扩大计数范围 b.计数20个细胞，出现1红1融合的比例>15%，判读为阳性 c.计数20个细胞，未发生红绿分离，但是出现了染色体多倍体，判读为阴性 比对HE或IHC结果确认肿瘤区域，结果有以下几种可能：
a.计数20个细胞，1p红绿比值小于0.75，结果判读阳性 b.计数20个细胞，19q红绿比值小于0.75,但是提示染色体有多体现现象，结果判读阳性 血液或骨髓样本与组织样本的最大区别是成分简单，病变细胞均匀分布，且细胞核的结构完整大部分判读相对比较容易，但是有些基因结构改变的由于断裂点不恒定，信号模式相对复杂。
(1)M-BCR区，位于外显子b1～b5之间5.8 kb的区域，转录成b2a2或b3a2型mRNA，编码210 kD的BCR/ABL融合蛋白(p210)，见于90%以上的CML和33%的Ph＋成人BALL患者 (2)m-BCR区，位于外显子e1′和e2之间的54.4kb的区域，转录成e1a2型mRNA，编码190 kD的融合蛋白(p190)，见于2/3的Ph＋成人BALL、3%的非典型CML 因此，根据断裂位点不同，有以下几种探针： 1.BCR/ABL（DF）探针，标记红色片段横跨ABL区域，如果在不同位置断开，都会有两个断裂红点；同样绿色片段横跨BCR区域，如果在不同位置断开，也会有两个断裂绿点，所以该探针不能区分M-BCR与m-BCR。
这是DF探针检测时，形成1红1绿2融合的原理：
2. BCR/ABL（SF）探针，标记红色片段未横跨ABL区域，如果在不同位置断开，形成一个单红；同样绿色片段未横跨BCR区域，如果在不同位置断开，形成一个单绿，所以该探针不能区分M-BCR与m-BCR。
这是SF探针检测时，形成1红1绿1融合的原理：
3. BCR/ABL（ES）探针，标记红色片段横跨ABL区域，如果在不同位置断开，会形成两个红点；绿色片段横跨BCR区域为M-BCR 左侧m-BCR ，如果在m位置断开，会形成2个绿点，产生2个融合信号，如果在M位置断开，会形成1个绿点，产生1个融合信号，所以该探针可以区分M-BCR与m-BCR。
这是发生m-BCR断裂，会形成2个断裂绿点，从而与2个断裂红点形成2个融合信号原理：
这是发生M-BCR断裂，会形成1个断裂绿点，从而与2个断裂红点形成1个融合信号的原理：
|
|
|
