去年 2 月,全球首家“环状 RNA”新锐 Orna Therapeutics 以 8000 万美元的融资走出隐匿模式,这家公司的成功“出圈”一举带火了环状 RNA,让其成为 RNA 领域最新的研究热点。环状 RNA(circRNA)是一类特殊的非编码 RNA 分子,呈封闭环状结构,不受 RNA 外切酶影响,因而可以更加高效和稳定地表达蛋白质。除了天然的 circRNA,合成的 circRNA 和一些内源性 circRNA 也可以编码蛋白质,这大大提高了 circRNA 作为基因表达平台的前景。(来源:Nature Biotechnology)试验之初,为了实现 circRNA 的更高通量测试,Howard Chang 团队构建了一个模块化的克隆平台。借助该平台,他们可以较为精确地分析对 circRNA 优化和设计的各个方面究竟如何影响其翻译。▲图|用于 circRNA 的模块化克隆平台可实现快速的设计-构建-测试周期(来源:Nature Biotechnology)在这项研究中,Howard Chang 团队对 circRNA 进行了优化,包括上游 IRES 拓扑、5' PABP 间隔区、HBA1 3' UTR 和 HRV-B3 IRES 与近端环 Apt-eIF4G 插入结合在一起,以测试 circRNA 在体内的表达。通过腹腔注射给小鼠注射编码 NanoLuc(萤光素酶)的 circRNA,与未经治疗的小鼠相比,接受 circRNA 的小鼠在 1 小时内表现出更高的发光活性,表明工程化的 circRNA 可以在体内表达。▲图|工程化 circRNA 在体内表现出更持久的翻译和功能活性(来源:Nature Biotechnology)随后,Howard Chang 团队使用编码人类促红细胞生成素(hEPO,一种用于治疗贫血的分泌蛋白)的 RNA 在经过环化改造后,与未经修饰的 mRNA 在体内的进行比较。通过 CAR-T 对小鼠进行静脉内给药后,改造后的 circRNA 的血浆 hEPO 水平最初低于未经修饰的 mRNA 的水平,48小时以后(见上图),改造后的 circRNA 的血浆 hEPO 水平远高于未经修饰的 mRNA 的水平。这表明,工程化的 circRNA 可以在体内以与修饰的 mRNA 相似的强度表达,而且持续时间更长。“为了让 circRNA 的翻译实现最大化,我们优化了五个要素,包括载体拓扑结构、5' 和 3' 非翻译区、内部核糖体进入位点以及合成适体启动翻译机制。”斯坦福大学医学院皮肤病学和遗传学教授、霍华德·休斯医学研究所研究员 Howard Chang 教授表示,“通过这些优化设计,我们把 circRNA 蛋白质产量提高了数百倍,在体外可以提供比 mRNA 更多的翻译,在体内可以提供更持久的翻译。”▲图|斯坦福大学医学院 Howard Chang 教授(来源:Howard Hughes Medical Institute)在哈佛医学院获得医学博士学位后,Howard Chang 进入斯坦福大学医学院皮肤科进行临床实习。2018 年,他加入霍华德·休斯医学研究所担任研究员,研究方向主要围绕人类疾病的 RNA 表观基因组学。Howard Chang 课题组开发了预测、解剖和控制大规模基因调控程序的方法,这些方法为人类发展、癌症和老龄化提供了新的见解。目前,Howard Chang 课题组正在探索 circRNA 在疾病中发挥的作用,他和团队发现在基因控制方面,circRNA 具有不同的作用模式,是一些人类疾病(比如癌症)的关键因素。早在 1976 年,人类便在电子显微镜下首次观察到了真核细胞中存在的 circRNA 分子,但受限于当时的技术水平,科学家们无法对其进行充分而详实的研究。直到 2012 年,斯坦福大学和霍华德·休斯医学研究所的科学家们证实在人体细胞的基因表达程序中,相较于线性 RNA 分子,circRNA 分子是一个更普遍的特征,它们稳定且普遍地存在于真核细胞中。随后,两项发表在 Nature 上的研究揭示出很多 circRNA 充当分子“海绵”:circRNA 分子富含 microRNA 结合位点,其通过与疾病关联的 microRNA 相互作用进而在疾病中发挥重要的调控作用。此外,研究人员推测 circRNA 还具有许多其他的功能,这些 circRNA 分子构成了一个“隐秘而未知的 RNA 平行宇宙”。在经典的基因表达模型中,每个 RNA 分子由线性的化学“碱基”串联组成,由于反向剪接而产生的非编码 RNA(circRNA)与传统的线性 RNA 不同,circRNA 分子呈封闭环状结构,不易被降解,能够大幅提高 RNA 的表达时长和表达产量。就现阶段而言,circRNA 才刚刚起步,虽然它的优势明显,产业化前景广阔,但现阶段还存在一些局限性,比如环化效率低,并且难以精准快速地制备,这都是其产业化过程中所面临的挑战。因此,上游的技术储备显得非常重要。这项最新的研究,通过一系列工程化技术手段将 circRNA 蛋白质产量提高了数百倍,为今后的产业化应用提供了一种新的途径。2.https://www./scientists/howard-chang3.https://www./2018-investigators/howard-chang4.https://baike.baidu.com/item/%E7%8E%AF%E7%8A%B6RNA/2192592?fromtitle=circRNA&fromid=19660786&fr=aladdin
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