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✦ cfRNA 作为评估转移性肺癌和其他肿瘤患者临床疗效的工具 ✦ Using cfRNA as a tool to evaluate clinical treatment outcomes in patients with metastatic lung cancers and other tumors 目的 进行一项探索性分析，将 cfRNA 作为一种生物标志物用于监测非小细胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌（BC）和结直肠癌(CRC)的临床疗效。在非小细胞肺癌队列中，cfRNA 可作为一种测量 PD-L1 表达的方法，并与临床反应进行比较。 方法 研究收集了 127 例正在接受治疗的转移性疾病患者的血液样本，其中 52 例为 NSCLC 患者，50 例为BC患者，25 例为 CRC 患者。cfRNA 从分离的血浆中纯化，随后被逆转录(RT)，通过实时聚合酶链反应 (qPCR)分析总 cfRNA 和 PD-L1 基因表达，检测β-肌动蛋白的表达对 cfDNA 和 cfRNA 进行相对定量。为了研究液体活检和组织活检的一致性，分离的 RNA 通过 RNAseq 分析 13 个基因的表达。 结果 共收集了 373 份血液样本。RT后的平均 cfRNA PCR 信号比 cfDNA 高约 50 倍。在所有患者中均检测到 cfRNA，而在 88% 的患者中检测到 cfDNA。其中13个基因的表达水平与实体肿瘤组织的表达水平具有较高的一致性。在治疗过程中，cfRNA 水平的变化与治疗反应相关，在疾病进展(PD)中升高，在部分缓解(PR)发生时下降。在接受免疫治疗的患者中，随着时间的推移，PD-L1 的表达随着 PR 降低，随着 PD 升高。治疗前 PD-L1 水平可预测接受免疫治疗的患者的反应。 关键词 cfRNA, cfDNA, liquid biopsies, NSCLC, PD-L1 序言 致癌驱动基因组改变的检测通常基于肿瘤组织的测试来完成，然而在组织可用性有限的情况下，这可能具有挑战性。血液中遗传物质的分析（液体活检）”提供了一种侵入性较小的测试，循环细胞游离 DNA (cfDNA) 和 cfRNA 是凋亡和坏死事件的结果，在癌症中，由于肿瘤细胞的更高复制率和肿瘤来源的物质(包括核酸)不断释放到血液中，导致 cfDNA 和 cfRNA 增加。数字PCR和下一代测序(NGS)等高灵敏度检测技术的结合，使cfDNA越来越多地用于具有临床价值的分子改变检测。在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)中，cfDNA 可用于检测致癌驱动突变和耐药突变。这些策略的价值已经在EGFR等基因上得到了很好的验证，现在也在KRAS上得到了很好的研究，但不仅用于诊断目的，还用于使用酪氨酸激酶抑制剂后评估耐药，如 T790 突变。 cfDNA 量的早期变化已被证明可以预测转移性结直肠癌(CRC)患者对化疗的反应。然而，有时很难从血液中分离出足够的cfDNA 进行分析。与 cfDNA 相比，cfRNA 的分析有几个潜在的优势。首先，cfRNA 的存在水平可能高于 cfDNA 中相应的基因。cfRNA 可能仅包含那些对肿瘤发展有影响的突变。更重要的是，对 RNA 中基因的定量分析可以测量肿瘤基因表达，其中一些基因表达在肿瘤中通常高于正常组织。cfRNA 的存在可能会增加基因表达信息的量，包括 cfDNA 量不足以检测的情况。 PD-L1 是一种具有临床意义的生物标志物，对实体肿瘤(包括NSCLC)具有治疗意义，但目前分析需要组织免疫组化(IHC)染色。一种有效的血液检测可以对 PD-L1 表达水平进行分类，从而在确定治疗方案时减少或消除对肿瘤组织活检的需要。作为一种免疫抑制机制，PD-L1在许多类型的癌症中表达升高，并且通常与预后不良相关，并且可以预测对 PD-1 / PD-L1 抗体的反应。阻断这种相互作用的疗法已经在几种癌症类型中显示出非常有前景的临床效用。本研究小组对 760 例患者用 cfRNA 逆转录-PCR 检测 PD-L1 的初步数据显示，cfRNA 检测的 PD-L1 表达水平与 IHC 检测的肿瘤组织 PD-L1 水平相似。血浆中的基因表达也证明了与纳武利尤单抗反应的相关性，类似于 IHC 测量肿瘤组织中的 PD-L1 。这些探索性的结果为进一步的研究奠定了基础，这些研究旨在确定在治疗前和治疗中监测血液中 PD-L1 mRNA 水平是否可以为抗 PD-L1 治疗提供额外的预测价值。此外，在无癌个体中缺乏可测量的PD-L1 cfRNA，提示血液中PD-L1 cfRNA的存在可能是检测癌症复发的一个潜在标记，因为尚未在健康个体的cfRNA中检测到PD-L1。在本研究中，我们比较了cfDNA和cfRNA的水平，以评估cfRNA作为一种生物标志物在跟踪NSCLC、乳腺癌和CRC治疗结果中的效用。我们还测量了PD-L1 基因在 cfRNA 中的表达，以评估其与免疫治疗结果的关系。 方法 1 血液样本处理 在治疗前从转移性NSCLC、BC和 CRC 患者中抽取20 cc的血液样本至Streck管中，并每隔三个月或进展一年进行一次，同时通过 CT 扫描监测患者的临床治疗结果，作为这些实体肿瘤的标准护理。Streck 管含有专有的核酸保存液，应在24小时内送往实验室进行提取。提取后的 cfRNA 应立即逆转录为互补 DNA (cDNA)， cDNA保存在4℃。其余血浆保存在-80°C，保存两年以内可获得基因表达一致的 cfRNA 。 2 PCR定量 采用实时荧光定量 RT-PCR 检测 cfRNA 中的基因表达。CR分析使用随机引物逆转录和基因特异性引物探针扩增完成。通过比较管家基因β-肌动蛋白各自的PCR信号，分析患者血液中 cfRNA 和 cfDNA 的相对含量。分别对每个患者两个相同的血液样本分离的血浆中的 RNA 和 DNA 进行定量。根据 RECIST 标准:CT扫描确定完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、疾病稳定(SD)和疾病进展(PD)， qPCR定量的 cfRNA、cfDNA 和基因表达的相对水平的变化与患者对治疗的反应相关。 3 RNAseq分析 在一项一致性研究中，使用 Burning Rock Biotech LTD 对 87 个组织-血浆配对样本进行了全转录组 RNA序列分析。从血浆中提取细胞游离核酸，用 DNA 酶处理去除 cfDNA 和基因组 DNA。使用随机六聚体引物对RNA 进行逆转录，以捕获每个样本的整个转录组。将得到的 cDNA 转化为 DNA 文库进行扩增。清除核糖体和线粒体 RNA 序列。该程序用于从匹配的肿瘤组织 RNA 中创建和分析 RNAseq 文库。对 87 例组织-血浆配对样本(包括NSCLC 和 CRC)进行全转录组 RNASeq 分析。比较配对组织和血浆样本中代表性生物标志物的表达。 结果 共有127例正在接受积极治疗的转移性疾病患者纳入研究: 52 例非小细胞肺癌患者，50 例乳腺癌患者，25 例结直肠癌患者。大多数患者为女性(63%)和非西班牙裔(67%)。在非小细胞肺癌患者中，大多数人(87%)以前或现在有吸烟史。血液中cfRNA信号中位数约高于 cfDNA 中位数50倍(P < 0.001)。  图 1. 在相同的患者血浆中来自 cfRNA (其为cDNA) 和 cfDNA β-肌动蛋白的 PCR 信号。P < 0.001 表示中位数信号值的差异。 大多数 cfRNA 和 cfDNA 值在10倍范围内，有一些高的和低的异常值。cfRNA 在所有样本中均可定量，而 cfDNA 太低，无法在 12% 的样本中定量。在 10名 健康志愿者中，cfRNA 太低而无法准确测量（ct >36）。利用 RNAseq 对 87个 组织-血浆配对样本(包括NSCLC和CRC)的总转录组进行了血液和肿瘤组织中生物标志物(13个基因）表达的一致性研究，包括 PD-L1，PD-L2 和PD 。  图2. 通过RNAseq测定 13 个基因在配对血浆和组织样本中表达的一致性 组织和血浆表达之间的定性一致性达到 84% ，定量相对表达一致性达到 76% (未发表数据)。为了评估 cfRNA 和 cfDNA 含量的变化与治疗结果之间的一致性，在治疗开始时和化疗期间的不同时间使用 PCR 扩增 β-肌动蛋白检测 cfRNA 和 cfDNA 。比较 CT 扫描确定的化疗方案的治疗效果与 cfRNA、cfDNA 水平的变化。  图3. 治疗过程中 cfRNA 和 cfDNA 水平的变化。在治疗开始时和化疗期间的不同时间采用PCR扩增β-肌动蛋白检测 cfRNA 和 cfDNA 。通过 CT扫 描确定治疗效果。  图4. cfDNA 无法测量时，治疗期间 cfRNA 水平的变化。在治疗开始和化疗期间的不同时间使用 PCR 扩增 β-肌动蛋白检测 cfRNA 和 cfDNA。通过 CT 扫描确定化疗方案的治疗效果。 例如，患者2[图3]经历了初始 PR，伴随总 cfRNA 和 cfDNA 下降，随后随着患者转变为 SD 状态，两种核酸平行增加。患者 25 在治疗过程中出现 PD, cfRNA 大幅升高，cfDNA 小幅升高。这些结果表明，当 cfDNA 可测量时，cfRNA 和 cfDNA 总水平的变化是一致的，因此 cfRNA 可能是治疗疗效随时间变化的有效监测指标。cfDNA 的PCR信号明显低于 cfRNA 信号。 在 6/48 例 NSCLC 患者的血样中(12%)，cfDNA 的 PCR 信号超出了 PCR 定量范围，但 cfRNA 仍然可以稳定定量。在 3 例 cfDNA 水平无法量化的患者中，我们很容易观察到 cfRNA 的变化[图4]。患者29 在 carbo/pemetrexed 治疗 PD 时 cfRNA 增加，但当改用 nivolumab 诱导 PR 时 cfRNA 下降。在患者4和11中，cfRNA 水平都随着 PD 的发生而开始增加。这些结果表明，当 cfDNA 过低而无法测量时，cfRNA 可能是一个有用的化疗疗效的生物标志物。154 例BC、84 例 CRC 和 135 例 NSCLC 患者样本的数据显示，治疗反应与 cfRNA 水平变化之间存在相关性[图5]。  图5. 总 cfRNA 与对不同肿瘤类型的各种治疗的反应。条形图分析了 154 例BC, 84 例 CRC, 135 例NSCLC 患者样本。 cfRNA 的增加主要与 PD 相关，而大多数 PR 或 SD 病例的 cfRNA 水平没有增加，但变化幅度很小或没有变化，最后显著下降(P < 0.001, Kruskal-Wallis test)。根据这些数据计算，利用 cRNA 水平的变化预测治疗结果的敏感性和特异性分别为 95.8% 和 93.3%。cfRNA 分析的优点之一是可以测量特定基因的表达水平。在 5 例 NSCLC 患者的免疫治疗过程中监测 PD-L1 的表达。  图6. cfRNA 测定患者抽血时 PD-L1 基因表达与化疗反应的关系 在这组的三名患者接受了治疗，初始治疗 (pts. 2 and 5) 或初始治疗失败 (pt. 46)，PR 的发生与 PD-L1 表达的降低相关，而 PD- L1 表达的增加发生在两例 PD 患者 (pts. 7 and 46)。患者 46，其最初的 PD 伴 PD- L1 急剧上升，随后在改变治疗导致 PR 后 PD- L1 同样急剧下降。在大量接受免疫治疗的患者中，PD- L1 表达增加与 PD 之间的关联得到了证实。图7  图7. 免疫治疗过程中 PD-L1 基因表达的测定化疗包括 carbo-pemetrexed ;靶向治疗包括厄洛替尼、奥希替尼和克唑替尼。NSCLC: 非小细胞肺癌。 治疗前 PD-L1 表达水平与免疫治疗反应相关。PD- L1 高表达与反应相关，而PD- L1 低表达与 PD 相关。PD-L1 表达在未接受免疫治疗的患者中不能预测。图8  图8. 预处理后 PD-L1 基因表达量的测定。(A)接受免疫治疗的 NSCLC 患者。(B) NSCLC 患者的非免疫治疗。 讨论 近年来，cfDNA 作为确定癌症相关基因组改变(包括点突变、拷贝数变化和甲基化标记)的来源被广泛研究。然而，与cfDNA 的使用相关的许多实际技术问题，主要是 cfDNA 基本上是碎片化的（约160 bp），其浓度通常较低（<10 ng / mL血浆），并且典型患者抽血中肿瘤来源的cfDNA的比例通常很小（通常<1%）。这些问题代表了其应用于早期癌症检测或分析的潜在障碍。cfRNA 的存在可能作为一种更敏感的血液癌症筛查手段，但这将需要更广泛的研究。另一个问题是区分 cfDNA 突变信息和良性变异体(如克隆造血)的能力。cfRNA 的检测可能没有同样的潜在局限性，但在得出结论之前，还需要进一步的研究和经验。DNA 只包含一个基因的一个拷贝，或者在基因扩增的情况下含有几个拷贝，而表达的基因可以被转录多次，而且，特定基因的过表达经常发生在肿瘤中，导致血液中肿瘤衍生的 RNA 信号进一步扩增。这种癌症检测和表征的方法是在最近的一项研究中开发的，其中在乳腺癌和肺癌患者中鉴定出以组织和亚型特异性方式高度表达的 cfRNA 生物标志物基因，不仅可以提高检测能力，还可以鉴定不同的癌症。 可以从血浆中回收全长 mRNA，表明 cfRNA 在血液中相对稳定，可能通过与蛋白质结合或通过紧密缠绕的二级结构来保护。RNA 储存管（Streck RNA BCT管）可稳定 cfRNA 并防止溶血，为稳定 cfRNA 进行评估提供了进一步的机会。本研究的结果与预期一致，由于多次转录事件，cfRNA 往往比 cfDNA 更丰富。我们发现 cfRNA 的平均 β-肌动蛋白信号比 cfDNA 的大约大 50 倍。尽管需要注意的是，由于RNA 逆转录为其 cDNA 时需要额外的扩增步骤，这个信号比并不表示血浆中cfRNA和cfDNA的实际相对数量。然而，cfRNA 和 cfDNA 之间信号强度的差异可能会导致更高的敏感性。例如，cfRNA 的高信号强度可能会增强术后微小残留病(MRD)的检测和监测能力，这就需要高灵敏度的突变检测来可靠地预测疾病复发。我们观察到cfRNA是可量化的，并且变化与 RECIST 定义的反应相关，而 cfDNA 是不可检测的，但其可靠性需要更多的研究。如果 cfRNA 分析对癌症检测和监测有用，那么 cfRNA 和肿瘤组织中的生物标志物之间的一致性是至关重要的。在本研究中，NGS 分析显示，cfRNA 中的多个基因表达与配对的组织样本中具有良好的一致性。之前对各种癌症 cfRNA 中 PD-L1 表达的研究也表明，cfRNA 中 PD-L1基因的相对表达水平与相应肿瘤组织中 PD-L1 的 IHC 分析具有良好的相关性。最近，Larson等人鉴定出了组织和癌症特异性基因，这些基因在血浆中的水平与其在匹配组织中的RNA表达相关。这些结果表明肿瘤组织中基因的表达也反映在 cfRNA 中，进一步倡导在 cfDNA 含量较低的患者中使用 cfRNA 加强癌症检测。为了评估cfRNA作为一种治疗监测工具的有效性，我们试图跟踪癌症患者在治疗过程中的总cfRNA 。cfRNA 水平和 RECIST 反应之间存在多个时间点的一致性，且与肿瘤类型或治疗方案无关。与PD 相关的 cfRNA 信号的增加可能反映了 cfRNA水 平的升高，这是由于肿瘤肿块的增长和/或肿瘤物质流入血液的增加，而 cfRNA 信号的降低通常伴随放疗。 除了使用全 cfRNA 作为肿瘤反应的一般标记物外，cfRNA 还可以为血液检测PD-L1表达的相关性提供机会，这至少与组织中的 PD-L1 免疫组化一样可靠。一些疗法被认为在 PD-L1 表达高的时候最有效(e.g., pembrolizumab or atezolizumab without chemotherapy)，而 PD-L1 的血液检测提供了一种非侵入性的方法来识别这些患者。而 PD-L1 的血液检测提供了一种非侵入性手段来识别这些患者。PD-L1 的相对基因表达是通过将 PD-L1 的 PCR 信号表达归一化为 β-肌动蛋白而获得的，因此与总 cfRNA 水平无关。提供的数据表明，cfRNA 也可以作为接受检查点抑制剂治疗的个体的反应标志物。 我们承认，这项工作作为探索性分析具有局限性，数量和临床数据有限，虽然还不能得出明确的结论，但这为开展更多关于 cfRNA 的实质性研究提供了理由。 总之，尽管无法从这个探索性队列中得出明确的结论，但这些结果令人信服地表明 cfRNA 在临床实践中的潜在应用，并为进一步分析提供了理由。需要强调的一个重要方面是，在本研究中所有患者样本中，cfRNA 水平都是可测量的，而12%的患者样本“超出了检测范围”，不能准确测量 cfDNA 水平。根据我们的经验，在 2000 多例分析了多种肿瘤类型的癌症患者样本中，cfRNA 的水平都是可测量的。这些结果表明，使用 cfRNA 可能是监测患者疾病状态的一种有用的补充。在接受检查点抑制剂治疗的患者中，通过 cfRNA 监测 PD-L1基因表达似乎与 RECIST 反应相关。正如预期的那样，当治疗是化疗或靶向治疗时，与检查点抑制剂治疗相关的 PD-L1 cfRNA 水平是看不到的。监测β-肌动蛋白的 cfRNA 表达更广泛地与治疗反应相关。在肺、乳腺和结直肠癌 PD-L1 基因相对表达的变化与免疫治疗结果特异性相关(90%)。患者的临床反应和 cfRNA 水平变化之间观察到值得注意的一致性，与化疗方案无关。我们的结论是，cfRNA水平的变化可能表明治疗反应，而 PD-L1 可能为监测免疫治疗反应提供有价值的信息。cfRNA 作为一种与 PD-L1 血液相关的治疗方案，以及作为一种正在接受检查点抑制剂治疗的患者反应评估的生物标志物，具有巨大的临床应用潜力。β-肌动蛋白的一般 cfRNA 表达可能为正在进行的疾病评估提供机会。在这项研究中，一组患者相对于 cfDNA 的敏感性更高，这也凸显了 MRD 评估的潜在优势。我们的研究结果表明，与癌症治疗相关的cfRNA检测具有相当大的潜力。在所有这些环境中都需要进一步的研究，以帮助指导在实践中可能需要采用的地方。 参考文献 Raez LE, Danenberg K, Sumarriva D, Usher J, Sands J, Castrellon A, Ferraro P, Milillo A, Huang E, Soon-Shiong P, Reddy S, Danenberg P. Using cfRNA as a tool to evaluate clinical treatment outcomes in patients with metastatic lung cancers and other tumors. Cancer Drug Resist 2021;4:1061-71. http://dx./10.20517/cdr.2021.78  点个赞 |
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