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作者：方玮婷，张媛媛，秦贻，陈竹 【摘要】目的分析固有淋巴前体细胞(innate lymphoid cell precursors, ILCP)和固有淋巴细胞(innate lymphoid cells, ILC)在类风湿关节炎(RA)患者外周血中的比例及其与临床和实验室指标的相关性。方法选取2020年9月至2021年2月就诊于安徽医科大学附属省立医院风湿免疫科诊断明确的RA患者和同期年龄性别匹配并排除免疫相关疾病的健康人群，流式细胞术检测外周血ILCP和ILC各亚群比例，分析其与疾病活动度和临床、实验室指标之间的相关性。结果RA活动组、RA稳定组和对照组三组之间比较，活动组RA总ILCs百分比高于对照组(P<0.05)；活动组RA患者ILCP、ILC2百分比低于稳定组RA(P<0.05，P<0.01)和对照组(P<0.05)，而ILC1百分比高于稳定组和对照组(P<0.01)。相关性分析表明，RA患者外周血总ILCs和ILC1百分比与疾病活动指数DAS28呈正相关(r=0.314 9, P=0.015 1；r=0.374 3, P=0.003 2)，而ILCP、ILC2和ILC3与DAS28呈负相关(r=-0.323 3, P=0.011 7；r=-0.267 1, P=0.039 1；r=-0.303 8, P=0.018 3)；抗CCP抗体滴度与ILCP和ILC3呈负相关(r=-0.488 3, P=0.001 0；r=-0.388 5, P=0.011 0)；ILC2与CD19+B细胞呈负相关(r=-0.604 4, P=0.024 8)。结论ILCP及ILC各亚群在RA活动期、稳定期及健康对照组之间存在差异，且与RA疾病活动度和部分实验室指标相关，ILC失衡可能在RA发病中发挥作用。 【关键词】类风湿关节炎；固有淋巴细胞 类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种以累及外周关节为主、以慢性侵蚀性滑膜炎为特征的系统性自身免疫性疾病[1]。近年研究发现，固有免疫系统参与了RA的发病机制[2]。固有淋巴细胞(innate lymphoid cells, ILC)是近年来发现的一群参与固有免疫的异质性淋巴细胞, 多位于黏膜屏障部位，接受局部微环境细胞因子的信号，通过分泌细胞因子及其他介质，发挥早期的免疫监控和免疫调节作用。基于分泌的细胞因子及所表达转录因子的不同，将其分为3大亚群，分别为ILC1群(包括NK细胞和ILC1，表达T-bet、Eomes和NFIL3，产生IFN-γ)、ILC2群(ILC2，表达Gata3，产生IL-4、IL-5、IL-13等细胞因子)和ILC3群(包括LTi和ILC3，表达RORγt，产生IL-17、IL-22和CM-CSF)[3]。近期研究发现，人体外周血存在ILC前体细胞(innate lymphoid cell precursors, ILCP)，可在体内和体外分化为ILC亚群[4]。越来越多的证据表明，ILC亚群可作为抗原呈递细胞，启动辅助型T细胞(Th)下游的免疫反应[3]。 研究发现，ILCs参与多种自身免疫性和炎症性疾病，如炎症性肠病、多发性硬化、系统性硬化症、ANCA相关性血管炎和RA的发生发展[2]。与Th1和Th17在RA中的致病效应相一致的是，ILC1和ILC3被认为在RA中发挥促炎作用，但相关研究结果不一致[2]。与此相反，ILC2可能在RA中具有抑制炎症的效应。在RA患者和小鼠关节炎研究中发现，活动期RA患者外周血ILC2数量减少，ILC2缺陷的小鼠关节炎明显加重，而活化ILC2可改善实验小鼠的关节炎[5-6]。目前ILCP和ILC其他亚群在RA中的临床意义尚不明确，本研究旨在分析ILCP和ILC各亚群在RA外周血的水平以及与临床和实验室指标的相关性，初步探讨其在RA发病机制中的作用。 1、资料与方法 1.1 一般资料 选取2020年9月至2021年2月就诊于安徽医科大学附属省立医院风湿免疫科门诊及住院的RA患者60例，所有患者诊断均满足1987/2010年RA分类标准。详细记录患者的基本信息(性别、年龄及病程)、临床特征 [肿胀关节数(SJC)、压痛关节数(TJC)、疾病活动评分DAS28]、实验室检查 [血沉(ESR)、C-反应蛋白(CRP)、类风湿因子(RF)、抗环瓜氨酸肽抗体(Anti-CCP)]及治疗情况。根据DAS28评分，将RA患者分为稳定组(DAS28≤3.2，29例)和活动组(DAS28>3.2，31例)。纳入同期在医院体检中心体检的性别年龄匹配，且排除免疫相关疾病的健康对照者32例。所有研究对象均签署知情同意书。 1.2 ILC亚群检测 空腹抽取两组对象5mL外周抗凝血，Ficoll密度梯度离心法分离获得外周血单核细胞(peri-pheral blood monouclear cells, PBMC)悬液并计数。取200 μL PBMC悬液，加入荧光抗体APC/Cy7-FVS、FITC-Lin(CD3、CD14、CD16、CD19、CD20、CD56)、BV510-CD45、PerCP-CD127、PE/Cy7-CRTH2、BV421-CD117、APC-NKp44、AF700-CD161(均来自美国Biolegend)，避光孵育30 min后，磷酸盐缓释液(PBS)洗涤，加300 μL PBS重悬，流式细胞仪上机检测ILC细胞比例(BD Canto Ⅱ)。 1.3 统计学分析 正态分布连续性变量采用(均值±标准差)表示，定量资料比较应用单因素方差分析、Mann-Whitney U检验及Kruskal-Wallis H检验，流式数据采用Flowjo V10软件分析，使用GraphPad Prism 6进行数据统计作图，所有资料用SPSS 22.0进行统计分析，以P<0.05为差异有统计学意义。 2、结果 2.1 RA患者临床资料 活动组患者RF、SJC、TJC、ESR、CRP、DAS28明显高于稳定组患者，差异有统计学意义。两组患者性别比、平均年龄、病程、抗CCP抗体滴度及用药情况差异无统计学意义(表1)。 表1 RA患者临床资料  RA：类风湿关节炎；Anti-CCP：抗环瓜氨酸肽抗体；RF：类风湿因子；CRP：C-反应蛋白；SJC：肿胀关节数；TJC：压痛关节数；ESR：血沉；DAS28：28个关节的疾病活动评分；DMARDs：改善病情抗风湿药; ns：差异无统计学意义 2.2 ILCs亚群的比例 三组实验对象外周血总ILCs、ILCP和ILC亚群(图1A)百分比比较：(1)活动组RA患者外周血总ILCs(FVS-CD45+Lin-CD127+)占CD45+细胞百分比高于对照组[(0.42±0.44)%比(0.24±0.11)%, P=0.014 1]，稳定组RA患者总ILCs与对照组百分比相当，差异无统计学意义(图1B)。(2)活动组RA患者ILCP(FVS-CD45+Lin-CD127+CD117+)占总ILC百分比低于对照组[(6.05±4.96)%比(8.78±4.77)%, P=0.0324]和稳定组RA患者[(6.05±4.96)%比(9.12±5.44)%, P=0.0286]，稳定组RA与对照组差异无统计学意义(图1C)。(3)活动组RA患者ILC1(CRTH2-CD117-)占总ILC百分比高于稳定组RA患者[(87.99±8.00)%比(81.43±7.06), P=0.0017]和对照组[(87.99±8.00)%比(82.35±7.09)%, P=0.005]，而ILC2(CRTH2+CD117-)占总ILC百分比显著低于稳定组RA[(8.43±6.18)%比(13.14±6.62), P=0.0069]和对照组[(8.43±6.18)%比(12.21±5.83)%, P=0.017 1]。稳定组RA患者ILC1和ILC2百分比与对照组差异无统计学意义(图1D、E)。活动组RA患者ILC3(CRTH2-CD117+)占总ILC百分比低于对照组[(3.49±2.79)%比(5.35±3.62)%, P=0.047 2]，稳定组RA与对照组之间无明显差异(图1F)。  图 1 RA患者外周血ILC亚群细胞 A.流式设门方法：总ILCs(FVS- CD45+ Lin- CD127+)、ILCP(FVS-CD45+Lin-CD127+CD117+)、ILC1(CRTH2- CD117-)、ILC2(CRTH2+ CD117-)和ILC3(CRTH2- CD117+); B.总ILCs占CD45+细胞百分比; C. ILCP占总ILCs百分比;D～F. ILC1、ILC2和ILC3占总ILCs百分比 RA：类风湿关节炎；Total ILCs:固有淋巴细胞总数；ILCP：固有淋巴细胞前体；ILC1：1型固有淋巴细胞；ILC2：2型固有淋巴细胞；ILC3：3型固有淋巴细胞；HC：健康对照；DAS：28个关节的疾病活动评分；ns：差异无统计学意义；*P<0.05,**P<0.01 2.3 ILCs亚群与临床和实验室指标间的相关性 相关性分析发现，RA患者外周血总ILCs和ILC1与DAS28呈正相关(P<0.05)，而ILCP、ILC2和ILC3与DAS28呈负相关(P<0.05)；ILC1与TJC和ESR呈正相关(P<0.05)，而ILCP和ILC3与ESR(P<0.05)和抗CCP抗体(P<0.05)呈负相关(P<0.05)。余临床和实验室指标与ILC亚群无明显相关性(表2)。 表2 ILCs亚群与临床和实验室指标间的相关性  DAS28：28个关节的疾病活动评分；SJC：肿胀关节数；Anti-CCP：抗环瓜氨酸肽抗体；CRP：C-反应蛋白；TJC：压痛关节数；ESR：血沉；RF：类风湿因子；Total ILCs: 固有淋巴细胞总数；ILCP：固有淋巴细胞前体；ILC1：1型固有淋巴细胞；ILC2：2型固有淋巴细胞；ILC3：3型固有淋巴细胞 2.4 ILCs亚群与其他免疫细胞间的相关性 进一步分析RA患者外周血CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD19+B细胞和调节性T细胞(Treg)的比例，发现ILCP和ILC3与Treg呈正相关(P<0.05)，而ILC2与CD19+B细胞呈负相关(P<0.05)(表3)。 表3 ILCs亚群与其他免疫细胞间的相关性  Total ILCs: 固有淋巴细胞总数；ILCP：固有淋巴细胞前体；ILC1：1型固有淋巴细胞；ILC2：2型固有淋巴细胞；ILC3：3型固有淋巴细胞；HC：健康对照；DAS：28个关节的疾病活动评分 3、讨论 越来越多的证据表明，ILCs参与多种炎症性关节病的发展。早期研究发现，RA患者关节液中ILC3明显升高，可产生IL-22和TNF-α，且与疾病活动呈正相关[7]。另一项在日本RA患者的研究结果[8]与之相似。Leijten等[9]报道，与银屑病关节炎(psoriatic arthritis,PsA)不同，RA患者关节液中ILC1是主要的ILC亚群。另一项研究发现，幼年特发性关节炎患者关节液中ILC1和ILC3均明显扩增，且ILC3的比例与临床特征呈正相关[10]。上述研究结果不一致可能与不同的研究入选患者的疾病活动状态、ILC设门策略各异有关。 本研究检测RA患者和健康对照者外周血ILCs各亚群的百分比，根据RA患者DAS28分为活动组和稳定组，分析其与患者临床表现、实验室检查及其他免疫细胞等的相关性，初步探讨其在RA发病中的作用。发现活动组RA患者总ILCs和ILC1百分比高于健康对照者，而ILC3百分比低于健康对照者。相关性分析发现，外周血总ILCs和ILC1与DAS28呈正相关，而ILC3与DAS28呈负相关，提示ILC1可能参与了 RA患者的发病过程。Rosser等[10]报道，幼年特发性关节炎ILC1、ILC3在患者的滑膜液中均有扩增，其中NKp44- ILC3与临床特征呈正相关。另一项研究发现，日本RA人群中CCR6+ILC3在患者滑膜液中的比例与TJC、SJC正相关，且是IL-17和IL-22的主要来源[8]。本研究ILC3分布与上述文献不一致，可能与不同研究对ILC3表面分子标记的定义、患者人种及病情活动性、用药情况等存在差异有关。 与ILC1和ILC3的促炎作用不同，ILC2被认为在关节炎中发挥抑炎效应。Omata等[11]报道，ILC2在稳定期RA患者的外周血及滑液中增多，且与疾病活动度呈负相关。进一步动物实验结果表明，ILC2可能通过分泌IL-4/IL-13抑制TNF-α和IL-1β的效应而发挥缓解关节炎症及骨破坏的作用。与前期报道[6, 11]一致的是，本研究也发现RA活动组ILC2低于稳定组和健康对照组，且与疾病活动指数呈负相关，提示ILC2减少和(或)功能障碍参与了RA的发病。笔者近期研究还发现，小分子肽神经介素U可通过活化ILC2缓解胶原诱导的关节炎，提示调控ILC2活化促进关节炎缓解有望成为RA治疗的新策略[5]。 最近有研究发现人外周血存在CD117+ ILCP，可在体内和体外产生所有的ILC亚群[4]。尽管调控ILCP分化成ILC亚群的机制尚不明确，但普遍认为其最终分化是在组织内[4]。目前ILCP在炎症性关节病中的意义尚不明确。本研究显示活动组RA患者外周血ILCP较稳定组和健康对照组明显减少，而稳定组患者和健康对照组无明显差异；与此同时，活动组患者ILC1百分比升高，提示ILCP可能通过迁移到炎症部位分化为ILC1发挥致炎效应。本研究RA活动组ILC3百分比低于健康对照组，但与稳定期RA患者之间没有差异，不排除ILC3因为较强的异质性和可塑性，从而向ILC1转换的可能性[12]。 综上，本研究发现ILCP和ILC亚群在RA患者外周血中分布失衡，且与疾病活动度、部分实验室指标及免疫学指标相关。虽然目前ILC在RA中的发病机制尚不明确，但现有的研究提示调控某些ILC亚群能为未来RA的免疫治疗提供可能。本研究仍存在一定的局限性。首先，患者来源于单中心，初发未治疗的患者较少，可能存在某些治疗药物对ILC的影响。其次，本研究为观察性横断面研究，尚未有足够的治疗前后对比研究，也限制了其在发病机制中作用的深层次探究。 参考文献：略 作者单位：230001 合肥，安徽医科大学附属省立医院风湿免疫科 通信作者：陈竹 |
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