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卓琦咨询：专注质量，深耕质量，提高质量 分析方法验证和确认的目的，是证明分析方法的适用性，对保证检测结果的一致性、可靠性和准确性具有重要作用。本文参考ICH Q2和作者的实际工作经验进行解析，供大家结合具体产品、具体检验项目进行参考。因含量测定的浓度比较大，通常是不需要验证检测限和定量限的。 一、线性和线性范围 通常使用对照品配制至少5个不同的浓度，该浓度范围应涵盖目标浓度的70%~130%。将峰面积和浓度进行线性回归，相关系数应R≥0.999 or R2≥0.998。如果在该浓度范围内的准确度和精密度都符合预定的标准，则可以确定线性范围。 二、准确度 通常用加样回收率来进行准确度的验证。以片剂为例来设计实验。将一定数量的药片研磨均匀，称取样品，样品称量数量通常与方法一致，加入已知量的对照品，按照方法进行后续的样品制备和检测。将实际检测的加入物含量除以理论上加入物的含量得到回收率。一般来说，制备三个浓度梯度，浓度范围涵盖70%~130%，每个浓度梯度制备三份样品。每一个样品的回收率应在100±3.0%，所有浓度样品的平均回收率应在100±2.0%。 三、中间精密度 根据实验室的实际条件来设置中间精密度的变化因素。不同的天数，不同的操作人员，不同的色谱柱批次，不同的设备都可以作为变化因素进行考察。可将变化因素按照正交实验的思路设计实验，测试同一批样品的含量。通常一个实验人员在不同的天数需要有6个含量结果，两个实验人员共有12个结果。举例：
将每个实验人员6个含量结果和两个实验人员12个含量结果计算RSD。其可接受标准与含量的标准范围有关，通常为含量范围的1/6。
重复性的验证也包含在中间精密度中。 四、专属性 如果产品杂质可获得，可将杂质加入至样品溶液中进行测试。如果产品杂质不可以获得，就比较复杂了。ICH Q2中认为可用含有杂质的样品的检测结果与用已经经过验证的方法测定的相同样品的含量结果进行对比。但在实际工作中比较难以找到第二个已经经过验证或公认的方法，因此该方法基本在实际工作中行不通。 个人认为可以使用类似强降解的方法产生杂质。在验证中需要证明目标峰与杂质峰、辅料峰等的分离度应符合规定。同时最好也使用二极管阵列检测器或质谱等来证明目标峰的纯度符合规定。 如果该含量测定方法也用于稳定性样品的含量测试，那么还需要证明该含量是稳定性指示的方法（stability indicating method)。用该专属性方法也可以证明是该方法稳定性指示的方法。 五、耐用性 方法耐用性验证需要根据方法本身来设计。例如，如果方法中有规定了振摇时间或超声时间，则需要通过耐用性来证明该时间是否对含量结果的影响。简而言之，就是方法中有可能会变化或影响的因素都需要通过耐用性来验证对结果的影响。 对于色谱法中常见的验证参数为：振摇/超声时间范围、pH变化范围、流动性比例的调节范围、流速变化范围等。耐用性中验证的参数越多，对该方法的了解越深，在日后使用该方法时则有更大的灵活度。如果参数没有对范围经过验证，那么每次实验都需要固定参数值，不能有变化。 在具体验证时，个人强烈建议一次变化一个参数，确定好该参数的范围后再进行下一个参数的验证。如果一次变化多个参数，结果差异较大不太好查原因到底是哪个参数的耐用性差。可接受标准的设置可以参照中间精密度来制订。 六、溶液的稳定性 有许多公司是另外起草验证方案来验证溶液的效期。但个人认为一个新方法在使用前，可以放在方法学验证中来测试。做好溶液的稳定性研究，确定储藏条件和期限，对后期方法的使用有很大的帮助，并可以避免一些因溶液降解导致的OOS事件。验证的可接受范围也可参考中间精密度的要求。 WHO、FDA、USP和ISO17025对于分析方法验证的定义和解释基本一致，其核心是实验室通过试验设计和测试，证明被验证的方法适用于该方法拟定的检测用途。从这个定义可以看出，方法验证主要上方法建立者进行，因此方法学验证的工作大部分由企业的分析方法研发部门进行、并随着产品研发的深入和质量控制方法变化而不断调整和优化
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