Effect of theobromine on dissolution of uric acid kidney stonesCite this article
Julià, F., Costa-Bauza, A., Berga, F. et al. Effect of theobromine on dissolution of uric acid kidney stones. World J Urol 40, 2105–2111 (2022). https:///10.1007/s00345-022-04059-3
目的 尿酸肾结石发病率高，复发率高。可以通过多种手术技术（体外冲击波碎石术、内窥镜检查、腹腔镜检查、开放手术）去除尿酸结石。这些结石也可以通过在肾脏内溶解来消除，因为当 pH 值高于 6 时，尿酸的溶解度要大得多。目前，N-乙酰半胱氨酸和尿碱化剂是唯一可以增加尿酸溶解的治疗方法。酸性结石。在本文中，我们比较了可可碱和N-乙酰半胱氨酸对体外 pH 6.5 人工尿液中尿酸结石溶解的影响。方法 尿酸肾结石的溶解在温控 (37 °C) 室中进行。每 24 小时使用蠕动泵将 750 mL 合成尿液 (pH 6.5) 通过胶囊。通过测量每次实验前后重量的变化来评估结石溶解情况。结果 N-乙酰半胱氨酸增加尿酸结石溶解，但效果无统计学意义。可可碱显着增加尿酸结石的溶解。两种物质一起具有与单独的可可碱相同的效果。在使用柠檬酸盐和/或碳酸氢盐的碱化疗法中添加可可碱是尿酸结石口服化学溶解的潜在新策略。结论 可可碱可以防止新结石的形成并增加现有结石的溶解。 尿酸肾结石发病率高，占肾结石的 10% 以上，复发率高，一年内可形成多处结石 [ 1 , 2 ]。肥胖和代谢综合征患病率的增加可能是近年来尿酸肾结石显着增加的原因 [ 3 , 4 ]。因此，尿酸肾结石是一个常见的、显着的、严重的公共卫生问题。尿酸肾结石可以通过口服尿碱化剂（例如柠檬酸盐）和/或尿酸结晶抑制剂（例如可可碱 (TB)）来预防 [ 5 ]。现有的尿酸结石可以通过多种手术技术去除，包括体外冲击波碎石术、内窥镜检查、腹腔镜检查和开放手术。然而，尿酸结石也可以通过在肾脏内溶解来无创地消除，因为尿酸的溶解度在 pH 值高于 6 时会大大增加。显然，溶解速度取决于结石的大小及其在肾脏中的位置，并且更大的灌溉会增加溶解速度。使用高剂量的柠檬酸盐可以使尿液碱化，有时还会伴随使用碳酸氢盐。然而，在某些情况下，口服高剂量的柠檬酸盐或柠檬酸盐和碳酸氢盐会导致胃部不适， 。然而，尽管没有在临床实践中广泛使用，但不经手术溶石具有明显的优势 。 N-乙酰 半胱氨酸 (NAC) 与尿碱化剂已被提议用于增加尿酸结石的溶解 。NAC 是一种粘液溶解剂，通过降低支气管分泌物的粘度起作用。它通过切割粘蛋白的二硫键来发挥作用，使它们的粘性降低 [ 12 ]，尽管目前的尿酸结石指南不推荐这种组合。 在本文中，我们比较了 TB 和 NAC 对合成尿液中尿酸结石体外溶解的影响。 材料和方法 试剂和溶液 尿酸、TB、NAC 和 escin 来自 Sigma-Aldrich（St. Louis, MO, USA），合成尿液成分来自 Panreac（Montcada i Reixac, Barcelona, Spain）。将分析试剂级纯度的化学品溶解在来自 Milli-Q 系统的超纯去离子水中。每天通过用 1 M NaOH 溶解 0.4 g/L 尿酸（最终 pH：10.52）制备尿酸储备溶液。通过将表1中所列所有物质的两倍量溶解来制备“浓缩”合成尿液溶液. 不包括钙和草酸盐以防止草酸钙结晶。这种“浓缩”合成尿液的 pH 值被调整到 6.20。在实验过程中，将等体积的尿酸溶液和“浓缩”合成尿混合，因此尿酸的最终浓度为 0.2 g/L，其他化合物的浓度如表 1 所示。 Substance Concentration (g/L) Na2 SO4 ·10H2 O 3.12 MgSO4 ·7H2 O 0.73 NH4 Cl 2.32 KCl 6.07 NaH2 PO4 ·2H2 O 1.21 Na2 HPO4 ·12H2 O 2.80 NaCl 6.53 Uric acid 0.20
Final pH = 6.5
实验程序 尿酸结石的体外冲击波碎石术 (ESWL) 碎片选自巴利阿里群岛大学健康科学研究所肾脏结石研究实验室的匿名肾结石样本集合。该集合来自肾结石研究实验室为巴利阿里群岛社区医院执行的常规肾结石诊断研究服务。使用我们实验室采用的一般方案对肾结石进行研究和分类。该方法包括使用光学立体显微镜、红外光谱法和扫描电子显微镜 (SEM) 。所有选择的片段具有相似的形态和大小。 在实验过程中（48 小时）保持在 37°C 的温度控制室中同时进行四个尿酸结石的体外溶解。在每个实验中，四个密封流动胶囊（图 1 ) 使用，每个包含 1 个尿酸结石片段，没有预处理。使用多通道蠕动泵以 375 mL/天的速率和 0.4 g/L 的溶液输送“浓缩”合成尿液溶液（溶液 A；pH 6.20），含或不含实验添加剂（见下文）尿酸（溶液 B；pH 10.52）以相同的速率。两种溶液均保持在 37°C 并在引入胶囊之前以 T 形连接混合。因此，每 24 小时有 750 毫升合成尿液（最终 pH 值：6.5）通过胶囊。这大约是每天通常通过一个人肾脏的尿液量。
用于检验不同治疗方法对尿酸结石溶解效果的实验模型。有关说明，请参见“材料和方法” 比较添加40 mg/L TB、20 mg/L NAC、40 mg/L escin或20 mg/L NAC与40 mg/L TB的混合物（NAC+TB）对尿酸结石溶解的影响与从用无添加剂的合成尿液处理的对照获得的结果。 还进行了使用更高浓度的 TB (80 mg/L) 和 40 mg/L TB 的 168 小时潜伏期的实验。 评估 每次实验前后，将结石在 37°C 下干燥 24 小时，直至达到恒重，使用精密天平测定。碎片溶解计算为重量变化。通过计算相对质量减少来确定和标准化平均溶出度，因此不考虑表面积的影响。 使用扫描电子显微镜 (Hitachi S-3400 N) 结合 RX 能量色散微量分析 (Bruker AXS XFlash Detector 4010) 观察样品溶解前后的形态和结构特征。 统计数据 通过检查图确定数据分布的正态性。数据表示为具有 95% 置信区间 (CI) 的平均值。对于连续变量，使用 ANOVA 和 Bonferroni 事后校正比较 3 组或更多组，使用学生 t 检验比较 2 组。小于 0.05的双尾 p值被认为具有统计学意义。 使用 SPSS 25.0 版（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）进行统计分析。 结果 我们首先考察了 NAC、TB 和 NAC + TB 对人造尿液中尿酸结石溶解的影响（图 2 ）。相对于对照，NAC 治疗增加了溶出度，尽管这种效果没有统计学意义。TB 治疗显着增加溶出度，TB 和 NAC + TB 的效果相似。因此，虽然 NAC 治疗没有统计学意义，但 TB 和 NAC + TB 治疗具有统计学意义。七叶皂苷不会增加结石溶解（数据未显示）。值得注意的是，在这些实验中，相同处理的样品之间存在很大的差异（图 2 )，大概是因为结石的结构不同。显然，最多孔的石头以比最致密的石头更高的速度溶解，但其他因素也会影响溶解，例如有机物覆盖石头（图 3 A，B）。我们的 SEM 图像显示 NAC 促进了结石上有机物层的消除（图 3 C、D），而 TB 加速了尿酸晶体的溶解（图 3 E、F）。尽管它们的效果不同，但当 NAC 和 TB 一起使用时，我们没有观察到相加或协同效应。
TB (40 mg/L)、NAC (20 mg/L) 和 NAC (20 mg/mL) + TB (40 mg/mL) 的混合物在 pH 6.5 时对尿酸结石溶解的影响。溶出百分比表示为平均值 ± 95% CI A 和中位数 ± 四分位间距 B ，每组重复 10 次。*与对照显着不同
尿酸结石的 SEM 图像。 A 、 B 溶解前：表面和更高的放大倍数，显示致密的尿酸结晶。 C 、 D NAC处理后：表面，显示有机物外层脱离，放大倍数较高。 E 、 F TB治疗后：表面和更高的放大倍数，显示尿酸结晶部分溶解。 G 在对照溶液中孵育 168 小时后，尿酸结石表面的尿酸钠和尿酸钾晶体。 H 尿酸结石表面“体内”形成尿酸钠钾针状晶体 将结石孵育 168 小时后，我们确定了具有大量钠和钾尿酸盐的区域（图 3 G），例如在一些尿酸肾结石表面观察到的区域（图 3 H）。 当我们使用较高的 TB 浓度 (80 mg/L) 时，溶出度高于对照 (21.9% vs 17.1%)，但与较低 TB 浓度下的溶出度没有显着差异。 讨论 TB 是黄嘌呤家族中的一种生物碱分子，存在于可可“豆”中，黑巧克力中含有约 1% 至 4% 的 TB 。TB 与咖啡因和茶碱有关，但它对中枢神经系统的影响比咖啡因弱 。由于TB 的结构特点，它可以抑制尿酸结晶，尤其是当尿浓度大于15 mg/L时 。因此，TB 是要描述的第一个潜在的尿酸结晶抑制剂。大约 20% 的摄入 TB 通过尿液排出 。结核病目前被认为是利尿剂和血管扩张剂，因此被用于治疗高血压患者。 以前的研究表明，皂苷（如人参提取物）、糖胺聚糖和糖蛋白也阻碍了尿酸的结晶[ 。然而，这些物质的影响是由于它们改变了水的表面张力。它们不是典型的结晶抑制剂，它们不影响成核或晶体生长，其中物质被吸附到晶体表面。重要的是，这些物质也不会引起剂量反应关系。 通常，抑制离子晶体形成的物质也抑制晶体溶解。例如，植酸盐抑制钙盐（草酸盐和磷酸钙）的结晶，但也抑制它们的溶解 。然而，我们在此表明，先前确定抑制结晶的 TB 促进了晶体溶解（图 2 ）。事实上，最近的一项研究发现，结核病和尿酸分子在溶液中相互作用，形成新的四聚体簇物种 。显然，这些物质的形成会降低尿酸的过饱和度并促进晶体的溶解。有趣的是，TB 对尿酸结石的作用与 NAC 完全不同。因此，NAC 降解了覆盖石头晶体的有机物沉积物（图 3 C，D），但 TB 加速了晶体的溶解（图 3 E，F）。虽然每种物质都改变了结石的形状，但 TB 在结石溶解方面更有效，并且这两种物质之间没有明显的相加或协同作用。 我们还发现七叶皂苷对尿酸结石的溶解没有显着影响。 值得注意的是 ，即使我们使用立体显微镜来选择尽可能相似的结石碎片，从相同处理中获得的溶解结果也存在差异（图 2 ）。 我们的 SEM 结果表明，这可能是因为在宏观上看起来相似的石头在微观结构上存在重大差异。特别是，这些石头在孔隙度、有机物分布和晶体尺寸方面存在差异。事实上，我们甚至在单个微积分中也观察到了这些差异。碎片在胶囊内的位置和碎片周围的液体流动也可能影响溶解。 我们的长期（168 小时）实验表明，对照中存在一小块结石，在这些结石中形成了钠/尿酸钾晶体的沉积物（图 3 ） G）。显然，这些沉积物的形成是高 pH 值和高尿酸浓度的结果。不幸的是，这些沉积物不能在高 pH 值下溶解。在 TB 存在下，由于尿酸盐-TB 簇的形成，尿酸盐的过饱和度降低，这些沉淀物的形成减少。在长期溶解过程中，当 pH 值非常高时，尿酸盐沉淀的形成会变得很明显。在这种情况下，TB 病可以防止新结石的形成，还可以通过降低现有尿酸盐的过饱和度来减少不溶性尿酸盐的形成。在任何情况下，都应避免高于 7 的 pH 值，因为这会导致形成覆盖在石头上的钠/钾尿酸盐或磷灰石盐的硬壳，从而无法溶解， 23 ]。不溶性尿酸盐（钠/钾）[ 6 ] 的形成只有在由于尿液中尿酸、钠和/或钾的浓度超过这些盐在该培养基中的过饱和条件时才会发生。在尿液中尿酸、钠和钾浓度较低的情况下（由于大量饮水和/或给予别嘌醇而导致尿液非常稀释），不会达到这种过饱和，因此不会发生这种沉淀。尿液 pH 值越高，通过增加尿酸的离子化 [ 11 ]，也将有利于尿酸盐结晶过程。可可碱与尿酸结合形成四聚体，增加其溶解度 [ 22 ]，所以在一定程度上还可以防止不溶性尿酸盐的形成。幸运的是，在“体外”实验中观察到的这些不溶性尿酸盐的形成 [ 6 ]，我们也在本文介绍的研究中检测到，似乎不是很常见，尽管我们已经检测到它们一些患者存在肾结石（图 3 H）。 最后，我们的实验还表明，使用更高浓度的 TB (80 mg/L) 不会带来额外的好处。 结论 当使用口服化学溶解治疗尿酸性肾结石形成者时，在由柠檬酸盐和/或碳酸氢盐组成的碱化疗法中加入适量的TB 可能会改善预后。TB 似乎有两个重要作用：防止新结石的形成和增加现有结石的溶解。TB 病还可以最大限度地减少不溶性钠/钾尿酸盐沉积物的形成。美国食品和药物管理局认为TB “通常被认为是安全的”。因此，我们建议此处提供的结果应通过临床试验来证实。
