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天然产物的化学变化为产生立体化学丰富且结构多样的小分子提供了一种强有力的方法。所得化合物具有不同于大多数筛选收集物的物理化学特征，因此是生物研究所需复杂小分子的极好来源。2019年5月13日，来自University of Illinois的Paul J.Hergenrother研究组在Nature Chemistry发表题为“Diverse compounds from pleuromutilin lead to a thioredoxin inhibitor and inducer of ferroptosis”的研究论文，发现新型小分子ferroptocide能够抑制硫氧还蛋白并诱导铁死亡。 ——对截短侧耳素的改造—— 截短侧耳素具有一个五元环，一个六元环和一个八元环。作者通过一系列缩环，扩环等反应来改变截短侧耳素的环系统，得到了一组高度复杂且结构多样的化合物(图1)。其中有12种新型结构未被报道，并且大多数在大于25mg的规模下被合成。
图1 通过改造截短侧耳素的环系统合成化合物 ——抗癌表型筛选和化合物优化—— 使用卵巢癌细胞系ES-2测试所得化合物快速杀死癌细胞的能力，其中化合物P4具有6.7μM的IC50。对化合物P4进行[4+2]环加成修饰得到更有效的化合物P18（ferroptocide）， IC50为1.6μM。该化合物对从15名不同转移性癌症患者的肿瘤组织中新分离的原代癌细胞也具有强抗癌活性。在P18的基础上，进一步合成了仍具抗癌活性的带有炔基的探针P29及荧光探针P30（图2）。
图2 Ferroptocide的合成与评价 ——Ferroptocide诱导铁死亡而非凋亡—— Ferroptocide能够快速诱导多种癌细胞系的死亡，且死亡速度快于已知最快的促凋亡剂Raptinal，故作者怀疑Ferroptocide并非诱导细胞凋亡。Ferroptocide诱导的细胞死亡不能由凋亡抑制剂Q-VD-OPh阻断，死亡过程中未观察到PARP-1的降解，也未观察到凋亡的形态学特征（图3）。
图3 Ferroptocide诱导快速的非凋亡细胞死亡 作者发现ferroptocide诱导细胞ROS升高，使用C11-BODIPY探针观察到脂质过氧化，并且使用铁死亡抑制剂ferrostatin-1或DFO预处理对ferroptocide诱导的细胞死亡具有保护作用。RNA-seq数据也证明了铁死亡特异性基因(GCLC, GCLM, SLC7A11, CHAC1等)的上调。然而ferroptocide并未抑制铁死亡中心调节因子GPX4(图4)。
图4 Ferroptocide通过铁死亡杀死癌细胞 ——Ferroptocide共价修饰硫氧还蛋白—— 使用P29带有炔基的探针进行生物素-链霉亲和素pulldown实验，得到的结果中选择九种蛋白进行后续实验，GPX4未被鉴定为Ferroptocide的靶标。使用siRNA和CRISPR–Cas9最终确定硫氧还蛋白(TXN)为Ferroptocide共价修饰的蛋白（图5）。
图5 Ferroptocide选择性共价修饰其靶标 硫氧还蛋白具有五个半胱氨酸(C32, C35, C62, C69, C73)，通过点突变验证了Ferroptocide修饰硫氧还蛋白活性位点半胱氨酸(C32,C35)及相邻的半胱氨酸(C73) (图6)。即Ferroptocide影响了硫氧还蛋白活性位点的关键残基，抑制其在细胞中的活性。
图6 Ferroptocide影响硫氧还蛋白的活性位点半胱氨酸 ——Ferroptocide是免疫刺激性化合物—— 诱导非凋亡的化合物是有吸引力的抗癌药物，因为它们可能引发免疫反应。使用具有免疫活性的(Balb/c)和免疫功能低下(SCID)的4T1三阴性乳腺癌小鼠模型研究Ferroptocide的作用。对于有免疫活性的Balb/c组，化合物处理比对照组肿瘤生长减缓40%，而免疫功能低下的SCID组，化合物缺乏活性，表明T细胞和B细胞对Ferroptocide的体内活性具有作用(图7)。
图7 Ferroptocide调节免疫系统 ——总结—— 作者对截短侧耳素的环系统进行改造，得到一系列结构多样且高度复杂的化合物，并筛选得到化合物Ferroptocide。Ferroptocide在癌细胞系及患者原代癌细胞中快速诱导铁死亡。Ferroptocide通过抑制硫氧还蛋白(TXN)而非GPX4来诱导铁死亡。由于其诱导的非凋亡细胞死亡形式，这类化合物具有与免疫系统协同治疗癌症的潜力。 参考文献： Llabani, Evijola, et al."Diverse compounds from pleuromutilin lead to a thioredoxin inhibitor and inducer of ferroptosis." Nature Chemistry 2019 May 13.DOI: 10.1038/s41557-019-0261-6. |
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