【原】【蛋白设计】调节细胞因子受体拓扑结构诱导差异的红细胞生成反应

——生物学背景——

受体二聚化是大部分细胞因子和生长因子激活的Type I型细胞因子受体的基本特征。配体诱导的二聚化受体胞外结构域拓扑结构的变化会影响下游信号反应，但人们对其生理意义还理解不深。这是个复杂的问题，因为工程化配体需要系统研究配体受体二聚化构象与信号反应之间的关系，这些研究可以探索结构功能之间的联系，为药物发现做出贡献。而大部分的细胞因子能引起多样化的信号反应，这限制了其医学上的应用，因此需要调控细胞因子信号通路的新方法。

——论文研究——

今天笔者介绍一篇文章，通过拓扑调控细胞因子受体影响下游信号反应，从而导致差异的细胞命运。2019年5月24日，来自斯坦福医学院的K. Christopher Garcia课题组在Science在线发表题为“Topological control of cytokine receptor signaling inducesdifferential effects in hematopoiesis”的研究论文，文章设计的锚蛋白重复蛋白可以调控EPoR二聚化两单体间的取向和距离，并揭示了一些部分激动剂在红细胞生成过程中的偏向激动和时相选择性的效应(Mohan et al.)。

DARPin是紧密折叠的锚蛋白重复蛋白，常被作为结合骨架去设计自组装寡聚物。每个锚蛋白重复序列包含33个氨基酸残基，其中27个保守残基维持重复蛋白结构，6个表面暴露位置残基可以进行突变提高与目的蛋白的结合能力。作者首先利用酵母表面展示技术筛选与EPoR胞外结合域具备一定结合能力的DARPin，然后通过随机突变将其与受体结合的亲和力提高一万倍以上，获得EPoR结合的锚蛋白重复蛋白。为了让二聚化EPoR发挥激动剂的作用，在该蛋白的非结合界面设计结合的二聚界面形成同源二聚体。TIRF双色共追踪实验表明DARPin二聚体可以诱导活细胞表面EPoR二聚化，EPoR二聚可以起始下游一系列磷酸化事件，包括JAK2，STAT5，ERK等。

图1.调控EPoR的拓扑构象

作者设计了一系列DARPin同源二聚体，实现对二聚化EPoR单体间角度和距离的调控。通过在DARPin的C端插入不同数量的非结合锚蛋白重复序列（nonbinding P ankyrin repeats），实现对单体间角度的调控；在N端插入不同数量的非结合锚蛋白重复序列实现对单体间距离的调控；在二聚的DARPin的中间插入不同数量的非结合锚蛋白重复序列调控EPoR拓扑构象，插入的非结合锚蛋白重复序列越多则单体间的角度和距离越大（图1）。检测下游蛋白的磷酸化水平可以揭示不同二聚化EPoR构象对信号通路的调控作用，E_max表征最大反应水平，EC₅₀ 表征50%最大反应水平下的配体浓度。在EPoR角度调控方面，提高二聚化EPoR两单体间角度， STAT5磷酸化水平逐渐降低，其中A_angle_R4和A_angle_R5发挥部分激动剂的作用，而A_angle_R7不能起始下游信号。尽管一系列DARPin与可溶EPoR ECD具备相同的亲和力，但是它们具有右移的EC₅₀，即需要更高浓度诱导相同信号水平。高浓度下，A_R3可以偏向激活STAT1和STAT3，相似的高_pSTAT1在A_angle_R5和C_angle_R4刺激下亦可观测到，免疫印迹技术也证实了该偏向激活现象。对于EPoR距离调控方面，DARPin不会降低_pSTAT5和_pERK的反应水平，提高受体单体间距离仍然可以诱导相同的E_max，但是其反应曲线的EC₅₀值明显右移，受体单体间距离提高导致的EC₅₀偏移可能与受体间协同作用降低有关。另外，A_dist_R5可以诱导更高反应水平的_pSTAT1和_pSTAT3。总的来说，文章认为受体单体间角度和距离的提高，导致信号活性降低，与受体更慢的内化速率有关。

图2. 拓扑调控EPoR二聚体对红细胞生成的影响

红细胞生成与造血干组细胞（HSPCs）分化并成熟过程有关，可以通过配体刺激在2-3周内捕捉RBC发育过程来检测红细胞生成能力。作者使用这些改变角度和距离的DARPins刺激细胞，以CD71和CD235a或血型糖蛋白A作为早期红细胞生成及后期红细胞成熟标志物。EPO、A_R3、C_R3和A_dist_R5可以诱导HSPCs分化成CD235a⁺红细胞，其它诱导EPoR二聚体间更大角度和更远距离的DARPins不能诱导红细胞分化生成，同时延迟和削弱的红细胞生成能力也造成了细胞增殖能力的降低（图2）。刺激后第5日，EPO、A_R3、A_dist_R5有相似的红细胞分化效率，但第12日时，相比其他两种配体，A_dist_R5有更少的CD235a⁺CD71^-细胞，表明其可以特异性诱导早期红细胞生成但具备削弱的后期分化诱导能力。而对于C_R3而言，其有早期诱导分化的能力较弱但是后期分化诱导效率较高，具有选择性增强红细胞生成的后期能力。相对于EPO和A_R3，A_dist_R5的刺激导致早期阶段（day 5）更高激活水平的STAT1/3/5，但在后期阶段（day 12），A_dist_R5诱导更高水平的STAT1/3却更低水平的_pSTAT5。对于C_R3而言，早期阶段其也诱导较低的STAT5活性。这些结果表明通过改变EPoR二聚体的构象可以产生偏向的信号激活。

——小结——

文章介绍了一种探索受体二聚化拓扑构象改变对信号转导影响的策略，虽然作者还无法根据构象参数变化预测下游功能输出。但这种策略能很好得调控二聚受体的构象参数，可以用来确定给定配体是否是最优治疗标志物，最终发展成临床前的药理学工具。

参考文献：

Mohan, Kritika, et al. "Topological control of cytokine receptor signaling induces differential effects in hematopoiesis." Science 364.6442 (2019): eaav7532.

doi:10.1126/science.aav7532.