专访杨辉｜开发高特异性且安全的高保真Cas13系统

据统计，截至目前已知的遗传性疾病达 7000 余种，但绝大部分疾病都缺乏有效的治疗药物和方法。如今，包括 CRISPR-Cas9、CRISPR-Cas13、单碱基编辑等新型基因编辑技术的出现为这类疾病的治疗带来了希望。利用基因编辑技术对目的基因进行精确操作，实现基因定点替换、敲除或敲入，在分子水平上对致病基因进行编辑和修改。

以 CRISPR-Cas13 为例，这是一类由 RNA 介导的靶向 RNA 的基因编辑技术。先前的研究表明，CRISPR-Cas13 系统已经被证明可以在哺乳动物细胞中对靶 RNA 进行高效且特异性地敲低。然而，Cas13 普遍存在旁切活性，会造成脱靶效应，并且还可能会存在毒副作用，这成为 Cas13 走向临床应用所面临的最大障碍。

因此，如何降低或消除 Cas13 蛋白的旁切活性，开发更特异的高保真 Cas13 蛋白对基于 RNA 编辑的基因治疗策略研发和后续临床转化具有重要意义。

近日，辉大基因、中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）杨辉团队，利用蛋白质工程、流式细胞术、体外切割实验、全转录组测序等技术手段，对 Cas13 进行蛋白工程化改造、优化、筛选及验证，开发出了具有高效编辑活性和低旁切活性的高保真 Cas13 蛋白突变体 hfCas13d、hfCas13X.1(辉大基因独有）。这项研究对基于 RNA 编辑的基础研究、基因治疗策略开发以及临床应用打下了基础。

目前，这项研究发现已经以“High-fidelity Cas13 variants for targeted RNA degradation with minimal collateral effects”（靶向 RNA且极低旁切活性的高保真 Cas13 变体）为题发表在 Nature Biotechnology 上。

（来源：Nature Biotechnology）

“相较于 Cas9 介导的 DNA 编辑技术，基于 Cas13 的 RNA 编辑工具靶向动态转录的 RNA，不会对基因组造成永久性改变，而且可以通过剂量调整等方式控制 RNA 编辑效果，具有可逆性，相对来说更加安全。”该论文的通讯作者、中国科学院神经科学研究所研究员杨辉博士告诉生辉。

2007 年，杨辉本科毕业于上海交通大学生物技术学院，随后，他进入中科院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物研究所攻读博士学位，师从李劲松教授，研究方向为胚胎和干细胞领域。2012 年，他进入美国麻省理工学院 Whitehead 研究所从事博士后研究工作，期间，他和团队构建出全球第一只 CRISPR-Cas9 基因编辑小鼠。

2014 年，杨辉回国并担任中国科学院神经科学研究所研究员、灵长类疾病模型研究组组长，早期的研究方向是基于 CRISPR 技术在胚胎阶段的优化，后续开展了一些临床合作，如用 AAV 载体递送 CRISPR 基因编辑系统等，同时，他还曾获得国家优秀青年科学基金和国家杰出青年科学基金的资助。

 ▲图｜中科院神经科学研究所研究员杨辉（来源：受访者）

“筛选出高保真 Cas13 突变体，具有高编辑活性和低旁切活性”

Cas13 蛋白属于多结构域单一蛋白 RNA 内切酶，先前的许多体外研究表明，Cas13 蛋白激活后不仅能够对靶 RNA 进行切割，还能对其周围的任意 RNA 进行非特异性切割。

在这项研究中，杨辉团队首先开发了基于绿色荧光蛋白（EGFP）和红色荧光蛋白（mCherry）的双荧光筛选系统，用于在哺乳动物细胞中检测 Cas13 蛋白的旁切效应。基于该系统，团队设计靶向绿色荧光蛋白的 mRNA 的编辑系统，同时检测红色荧光蛋白的表达水平来表征旁切效应，结果他们发现 Cas13d 与 Cas13a 蛋白的激活都能诱导出非常显著的旁切效应。

▲图｜hfCas13d 蛋白的工程化设计、筛选及脱靶效应验证（来源：Nature Biotechnology）

为了降低或消除 Cas13d 蛋白的旁切活性，研究人员预测并对比分析了 Cas13d 的蛋白结构，并推测旁切效应的产生是因为 Cas13 蛋白与 gRNA 结合后，其核酸酶活性被激活，结构发生变化，核酸酶活性位点就会暴露在蛋白表面，继而对周围的 RNA 进行任意切割。

接下来，他们通过蛋白质工程对 Cas13d 进行一系列突变改造，从而改变它与非靶 RNA 的相互作用，并结合哺乳动物细胞转染、流式细胞术等手段，筛选出了一些具有高效编辑活性且旁切活性显著降低的 Cas13d 突变体，其中 Cas13d-N2V8 变体表现出了较好的特异性，是一种高保真 Cas13 蛋白突变体（hfCas13d）。

最后，杨辉团队进行了试验验证，通过对大量内源基因位点进行 RNA 敲低试验发现 hfCas13d 表现出与常规 Cas13d 同样的高活性，与此同时，他们结合体外切割实验、全转录组分析、稳转细胞系、转基因小鼠、在体靶向 RNA 敲低等技术，对 hfCas13d 进行了系统性的脱靶效应验证，以及有效性和安全性评估。

▲图｜hfCas13d 蛋白在哺乳动物细胞及个体有效性和安全性评估（来源：Nature Biotechnology）

“整个研究的核心，是这套双荧光筛选系统的建立，一个荧光指示靶向活性，一个荧光指示旁切脱靶活性。通过流式分选可以高效、大通量筛选各种Cas13d 的突变体，最后我们得到一种高保真的 Cas13d 的突变体，其靶向活性较高，能有效降解靶 RNA，而且没有旁切效应，动物试验也显示非常安全。”杨辉总结道。

这项研究开发出了具有“高效编辑活性”且“极低旁切活性”的高保真 Cas13d 突变体——hfCas13d，这种新工具展现出了更高的特异性和安全性，为接下来基因疗法的开发提供了新途径。

谈及开展这项研究的初衷，杨辉表示，“当时我们观察到用 Cas13d 蛋白进行转基因小鼠试验会导致小鼠死亡，那后续的基础研究和临床应用就都很难继续展开了，所以我们就想着力去解决这个问题，通过各种方法进行尝试。”

长期以来，杨辉课题组专注于 Cas13 系统的开发，值得一提的是，他和团队自主开发的 Cas13X 和 Cas13Y 于今年 1 月获得美国专利局的授权。“其实 Cas13Y 的旁切效应要比 Cas13d 低很多，虽然这项研究是针对的 Cas13d 和 Cas13X，而用我们开发的这套策略也可以在 Cas13Y 上进行开发，我们的这套策略是具有普适性的。”杨辉指出。

（来源：Pixabay）

谈及下一步的研究动向，杨辉表示，“在很多小动物模型上，我们已经看到了 RNA 编辑技术的治疗效果其实不输 Cas9，而且它的特异性较好，也比较易于递送（比如 AAV 即可进行递送）。所以，接下来我们首先需要找到 Cas13 的一些适应症，然后将其全力推向临床，这个是现阶段我们最大的一个目标。”

“其次，我们可能会做一些药物诱导的可调控的 RNA 编辑，即可调控，在我们需要的时候进行基因敲低，不需要的时候撤药，基因恢复正常表达水平，从而实现 靶标 RNA 实时、可逆化调控。”他说道，“再次，可以实现多位点编辑。每增加一个位点，碱基对可能只会增加 50 bp 左右，所以我们可以轻松增加 3~4 个位点。”

据杨辉介绍，现阶段正在开展的适应症——MECP2 重复综合征（MECP2 duplication syndrome, MDS），他们在小鼠中发现通过调控 MECP2 可以达到疾病治愈的目的。“我们目前在一些听力疾病、眼科疾病，以及神经系统疾病都观察到很好的体内治疗效果。下一步，我们将进一步在猴模型上验证。同时，我们首先会聚焦于解决一些罕见病，然后会进一步拓展到更广泛性的疾病。”他说道。

“开发底层专利技术打破海外技术封锁”

相较于 DNA 编辑工具，杨辉总结了 RNA 编辑工具的几个优势：

第一，相对较小。“DNA 编辑工具，Cas9 蛋白包含约 1300 个氨基酸，而 RNA 编辑工具则要小很多，很容易通过 AAV 载体进行递送。”他指出。

第二，可逆性。“因为 RNA 编辑工具是可逆的，发现效果不好可以进行关闭，而 DNA 编辑工具的改变则是永久性的，是不可逆。”杨辉补充道。

第三，可调控。比如，MECP2 重复综合征是由 MECP2 基因重复所致，然而该基因过多或过少都会导致患病，RNA 编辑工具可以很好的控制剂量，保证不会敲低过多或过少，但是 DNA 编辑工具却无法实现。

围绕 RNA 编辑技术，杨辉已于 2018 年创立了辉大（上海）生物科技有限公司（简称辉大基因），专注于罕见单基因遗传病以及威胁人类健康常见疾病基因治疗药物的研发和生产。

▲图｜辉大基因（来源：公司官网）

据了解，辉大基因总部位于上海，目前已建成研发实验室、药物工艺开发与分析实验室、模型动物试验中心等。公司全部成员近 200 人，其中，研发团队占 70% 以上。自成立以来，辉大基因目前已完成四轮融资，并与多家国内科研机构、医院达成深度合作。

现阶段，辉大基因研发管线涵盖中枢神经、眼科、听力、肌肉、肝脏等多个疾病领域，拥有多项专利技术平台，具备从药物靶点筛选、药物优化、高效动物模型构建，到药效、毒理分析等临床前研发，再到药物工艺开发、生产转化 CMC 以及药品临床及注册申报的一体化研发能力。

“除了拥有 RNA 编辑工具，辉大基因还布局了 DNA 编辑工具。比如，目前我们已经发现一个大约有 1000 个氨基酸的 DNA 编辑工具 Cas12Max ，它的效率比 Cas9 更高，而且这是具有底层专利的工具。”杨辉介绍说，“未来围绕 DNA 编辑技术的管线会聚焦在肝脏、肌肉，以及眼科等方面的相关疾病。”

▲图｜辉大基因在研管线（来源：公司官网）

谈到辉大基因中长期的发展规划，杨辉坦言，“现阶段，我们主要是解决一些基因编辑工具本身的问题，比如工具尺寸、效率、脱靶，同时解决 RNA 和 DNA 两个底层专利的问题。比如我们开发的 RNA 编辑工具 Cas13X 和 Cas13Y 已经获得美国专利局授权，我们是第一个得到美国授权的中国公司，最为关键的是我们 RNA 编辑工具的底层专利技术绕过了国外专利，而 DNA 编辑工具也已经递交专利申请。”

“有了底层专利，在这个底层专利的基础上不断地优化工具，等到基因编辑工具变得成熟，我们可能会走两条路线。”杨辉表示。“其一，推进自有管线，比如在眼科、耳科、神经系统等；其二，把专利授权给一些我们目前不涉及领域的公司，比如从事细胞治疗公司，以及农业公司。”

“我们目前已经在和国内外一些细胞疗法公司洽谈合作了。我们开发的底层专利工具打破了海外的技术封锁，我们希望中国公司能够在早期阶段就能用具有自主专利的工具去开发疗法，从而避免了使用国外专利工具所带来的各种不确定性。总而言之，我们希望辉大基因未来能够帮助国内以及国外的公司解决底层专利问题。”他补充说。

杨辉总结说，“我们的愿景，就是成为一家有以底层专利基因编辑技术为核心的公司，我们自己做一些药物管线的开发，同时，也希望能跟更多国内外的企业一起合作，造福人类健康。