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2020年7月中国科学院动物研究所Guang-Hui Liu教授于Cell Research上发表文章Stabilization of heterochromatin by CLOCK promotes stem cell rejuvenation and cartilage regeneration，其研究结果证明了clock在稳定异染色质、促进组织再生和减轻衰老相关慢性疾病方面的非典型作用。 核心的昼夜机制是一个进化保守的生物时间系统，负责同步哺乳动物的生理和行为与外部的光-暗周期和稳定组织和细胞内稳态。新出现的证据表明生物钟和衰老过程之间有密切的联系。在小鼠中，主要昼夜节律起搏器视交叉上核以及周围组织中观察到年龄依赖性的昼夜节律核心机制退化。在人类中，生物钟的失调表现为衰老过程中体温和皮质醇分泌节律的相位提高和幅度降低，以及眶额皮质中生物钟核心基因的振荡减弱。此外，昼夜节律紊乱已被证明会增加干细胞衰老和衰老相关的慢性疾病的风险，包括代谢性疾病、神经退行性疾病和骨关节炎。 衰老和生物钟之间不可分割的关系提出了两个尚未解决的问题:衰老如何影响生物钟，以及核心分子clock如何调节衰老过程。以往的研究表明，衰老以一种高度组织和细胞特异性的方式对昼夜节律转录组进行了重组。然而，核心生物钟导致人类衰老的机制仍然很大程度上是未知的。clock是哺乳动物分子生物钟的核心组成部分。它包含一个bHLH-PAS结构域，与BMAL1形成一个异源二聚体，作用于昼夜节律转录/翻译反馈环的正肢，并启动clock控制的基因转录。一些研究表明钟蛋白和衰老之间有相互作用。。clock单核苷酸多态性(SNPs)与肥胖、高血糖和2型糖尿病相关的心血管疾病、阿尔茨海默病和一组90多岁老人的衰老质量有关。此外，clock不足导致小鼠寿命缩短和衰老相关病理的发生，包括白内障和皮炎。然而，clock调节生物体衰老的分子机制和靶点在很大程度上仍未被探索。 干细胞老化是机体老化和衰老相关疾病发展的一个标志。例如，生理衰老和过早衰老疾病，如Hutchinson-Gilford早衰综合症(HGPS)，其特征是间充质干细胞(MSC)群的功能衰退，并伴随骨关节炎等疾病的发展。在许多因素中异染色质失联是导致间充质干细胞衰减的一个重要驱动因素，异染色质浓缩的恢复部分逆转了人类间充质干细胞(hMSCs)的衰老表型。正常的异染色质组织对于防止重复序列的异常转录和转座子的逆转录是必不可少的，例如在年轻细胞中的长散布核元件1 (LINE1)。据报道，重复序列(包括卫星DNA、核糖体DNA (rDNA)和转座子)的转录异常上调，以及逆转位的增加，会导致衰老相关分泌表型(SASP)的激活，并导致衰老过程中的基因组不稳定。然而，染色质组织和(epi)基因组稳定性是否受核心转录因子如clock的调控，仍然不清楚。在本研究中，作者发现昼夜节律转录因子clock与核板组分和异染色质相关蛋白形成复合物，以稳定异染色质，并保持hMSCs处于年轻的状态，而不依赖其转录活性。hMSC衰老过程中clock的下调导致异染色质失稳，重复基因组序列的转录，加速细胞衰老。clock或异染色质相关蛋白的恢复表达挽救了老化hMSCs的衰老缺陷。更重要的是，编码clock的慢病毒载体基因治疗促进了小鼠组织年轻化，减轻了与年龄相关的关节退化。这些结果表明，clock在维持核基因组组织和延迟干细胞衰老中的非典型作用，确定了一个新的治疗靶点，以对抗年龄社会化疾病。 
图1 ：CLOCK - / - hMSCs表现出与细胞衰老加速相关的表型。 为了研究hMSC衰老过程中生物钟的变化，作者首先利用PER2启动子(PER2- dluc)驱动下稳定表达荧光素酶的早、中、晚期hMSCs来测量复制性衰老对昼夜节律的影响。对荧光素酶(Luc)活性的连续监测显示，在中后期hMSCs中，PER2- dLuc报告振荡的振幅减弱和周期延长(图1a)。Western blotting显示，复制衰老hMSCs的核心昼夜节律转录因子clock下调，与PER2-dLuc振荡幅度降低一致(图1b)。同样，LMNA (p.g g608g)突变的早熟hMSCs (hgps特异性hMSCs)的clock蛋白水平也降低(图1c)。作者还观察到，从不同年龄的健康人类捐赠者中提取的初级hMSCs的clock蛋白水平随着年龄的增长而下降(图1d)。衰老表型的late-passage hMSCs, HGPS-specific hMSCs,主要hMSCs源自老年人的特点是增加数量的衰老相关 (SA) -β-gal-positive细胞和细胞克隆扩张能力下降。总的来说,这些发现表明,clock可能参与hMSC衰老。 为了研究clock在调节细胞衰老的作用,作者首先生成CLOCK-deficient人类胚胎干细胞(为)利用CRISPR -/-Cas9-facilitated同源重组删除生物钟基因的外显子。此外,clock没有改变hESC-associated特征,如hESC形态、DNA hypomethylation OCT4启动子,多能性,或体内分化潜力向三胚层血统。此外,没有细胞增殖能力的差异或细胞周期动力学观察之间的clock和clock / 为，生物钟对于维持hESC体内稳态是不可缺少的。接下来，作者将clock-/-hESCs分化为hMSCs(称为clock-/-hMSCs)，这是一种对衰老敏感的成体干细胞(图1e)。CD73、CD90、CD105、CD44、CD166、CD29、CD13和HLA-ABC等典型间充质细胞祖细胞标志物呈阳性，非间充质细胞标志物CD45、CD34、CD43、CD164、CD14、CD19和PDPN呈阴性。western blotting证实CLOCK -/-hMSCs中缺乏clock蛋白(图1f)。clock / 和clock-/-hMSCs都能分化成成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞，尽管clock-/-hMSCs在软骨形成中表现出轻微缺陷。正如预期的那样，PER2- dluc报告基因检测显示，在CLOCK -/-hMSCs中PER2基因转录的昼夜激活受到了损害。监测记录水平的关键生理蛋白质每3 h后同步(JTK_Cycle分析)透露,PER3的振荡,NR1D1和菲律宾NR1D2振荡的振幅在clock-/-hMSCs妥协,概括的表型衰老hMSCs。这些细胞的昼夜节律缺陷被重新引入clock到clock-/-hMSCs。 为了研究clock缺失是否介导了hMSC的衰老，作者对clock / 和clock-/-hMSCs进行串行传递。与衰老动力学正常的CLOCK / hMSCs相比，CLOCK -/-hMSCs早在传代4时衰老，在传代10时完全停止生长(图1g)。在CLOCK -/-hMSCs中检测到SA- gal活性增加、增殖势下降和s期细胞百分比下降(图1h j)。此外，clock缺失导致DNA损伤反应和SASP增强(图1k, m)。随着衰老表型的加速发展，作者观察到clock-/-hMSCs中LMNB1和TMPO的转录水平下调，衰老标记物CDKN1A (P21)和CDKN2A (P16)的mRNA表达上调(图1l)。最后，与clock / 细胞相比，clock-/-hMSCs在体内被植入免疫缺陷小鼠的tibialis前(TA)肌肉时呈现加速衰变(图1n)。为了进一步评估clock在调控细胞衰老中的直接作用，作者用编码CRISPR/Cas9的慢病毒和sgRNA靶向clock或非靶向控制(NTC) sgRNA转染clock / hMSCs。与CLOCK -/-hesc来源的hMSCs类似，clock失活的hMSCs表现出加速衰老，其特征是SA- gal活性增加，克隆扩展能力下降。综上所述，这些数据表明，clock是hMSCs的老年保护因子。 
图2:时钟与核层蛋白和异染色质相关蛋白KAP1形成复合物 为了阐明clock缺失加速hMSC衰老的分子机制，作者试图通过在HEK293T细胞中表达标记clock蛋白来识别新的clock相互作用蛋白，并使用抗衰老药物进行免疫沉淀随后进行质谱分析(IP-MS)(图2a)。标记荧光素酶作为阴性对照。作者鉴定了数百种蛋白，包括著名的生物钟蛋白BMAL1和CIPC，作为生物钟相互作用伙伴(图2b)。有趣的是，一组核层蛋白，如LBR和Emerin，以及异染色质相关蛋白KAP1，也在clock蛋白复合物中被鉴定(图2b)。共免疫沉淀(Co-IP)检测证实了HEK293T细胞和hMSCs中clock与核层/异染色质相关蛋白之间的这些新的相互作用(图2c, d)。接下来，作者绘制了此类相互作用所需的clock域。为此，产生了包括氨基酸在内的一系列标记标记的clock截断突变体(a.a) 1 379, a.a 1 651, a.a 380 651, a.a 380 846和a.a 652 846，异染色质相关蛋白KAP1和核层蛋白Lamin B1, LBR和Emerin通过a.a.1651与clock相互作用。KAP1的交互,核纤层蛋白B1和Emerin主要依赖clock,和交互LBR主要依赖同上380 651的clock。作为一个积极的控制,只有完整的clock与PER3互动,另一个核心生物钟因素受clock。这些新发现的在clock和异染色质成分之间的相互作用表明了clock在调节染色质组织中的作用。由于KAP1和Lamin B1通常聚集在H3K9me3富集的重复序列中，作者接下来通过染色质免疫沉淀-定量聚合酶链反应(ChIP-qPCR)来探索clock是否与异染色质区域相连。作者发现clock与异染色质丰富的元素结合，如周熵重复序列、长散布重复元素和rDNA(图2e)。以往的研究表明，Lamin B1、LBR和Emerin与异染色质组分相互作用，促进核外周的lamina-associated domains (LADs)的组织。与这一观察结果相一致的是，在CLOCK -/-hMSCs中观察到细胞核增大和异染色质丢失，其特征是核板蛋白LBR和异染色质相关蛋白KAP1、HP1和HP1的表达水平降低(图2f i)。 
图3 :hMSCs中异染色质维持需要时钟 为了研究钟是否参与了异染色质维持，作者在clock / 和钟-/-hMSCs中进行了DNA腺嘌呤甲基转移酶鉴定(DamID)分析。hMSCs中clock的缺失降低了DamID信号强度和整个基因组中LADs的覆盖(图3a）进一步显示了重复基因组序列的LAD缺失，包括着丝粒卫星、LINE1和rDNA位点(图3b)。ChIP-sequencing (ChIP-seq)和ChIP-qPCR分析显示，在CLOCK -/-hMSCs中，组成性异染色质标记H3K9me3在全基因组范围内缺失，尤其是在LADspecific异染色质区域(H3K9me3 mountains)(图3c f)。与染色质结构的变化相一致的是，晚发hMSCs的RNA测序(RNA-seq)发现一组与染色质凝结相关的基因在CLOCK -/-hMSCs中下调。考虑到重复序列的转录沉默需要维持异染色质，作者接下来检查了这些基因组元件的转录水平。正如预测的那样，重复元件，包括-Sat、LINE1和rRNA，在CLOCK -/-hMSCs中被显著诱导转录(图3j)。 
图4:时钟-异染色质轴保护造血干细胞抗衰老 衰老表型和表观遗传缺陷在CLOCK-deficient hMSCs获救的重新外生clock,可以减少百分比的SA -β-gal-positive细胞,克隆扩张能力,增加和恢复H3K9me3入住率在重复序列(图4 e)。这些观察结果表明,clock是一个新的异染色质在hMSCs稳定器。 接下来，作者分别在CLOCK -/-hMSCs中过表达已知的异染色质稳定剂(KAP1、HP1 - 3或HP1 - 3)，以确定clock是否通过维持异染色质发挥其老年保护作用。作者观察到衰老表型的缓解，类似于clock过表达的影响，如SA- schr - gal阳性细胞的百分比下降、克隆扩增能力增加、sps相关基因的表达下调和重复基因组序列的转录(图4f i)。这些数据支持了clock通过与核膜和异染色质成分的相互作用来维持异染色质组织来调节hMSC老化的观点。 
图5:时钟对抗hMSC的衰老独立于其转录活性。 clock有一个固有的乙酰转移酶域，可以通过乙酰化组蛋白和非组蛋白(包括其伙伴BMAL1)来实现昼夜染色质重塑，以促进昼夜clock控制基因的转录。因此,确定乙酰转移酶活动所需的clock是其监管作用hMSC衰老,作者进一步生成两个clock突变体,已报道表现出减少乙酰转移酶活动由于三个氨基酸的替换。随后的Co-IP分析显示，clock与核板蛋白相互作用，KAP1不依赖于乙酰转移酶区域(图5a)。此外，将外源性clock(Mut A)或clock(Mut B)引入clock-/-hMSCs中，可以有效挽救衰老表型，SA- gh -gal阳性细胞百分比下降，细胞增殖能力增强(图5b, c) clock拮抗细胞衰老独立于它的乙酰转移酶活性。然后作者研究了clock的衰老调节活动是否需要其下游靶基因的激活。为此,作者生成了一个人类同族体，以前报道的老鼠转录activity-inactive突变编码clock与删除的51个氨基酸蛋白质转录域。虽然clock-51保留的能力与核板和异染色质相关蛋白质相互作用,异位表达clock的clockΔ51 -/-hMSCs未能诱导clock靶基因的转录,包括PER3和NR1D2(图5 d, e)。值得注意的是,类似于其野生型(WT),clockΔ51保留了在clock-/-hMSCs救援细胞衰老的能力(图5 f, g)。 
图6:时钟过表达衰减hMSC老化 综上所述,这些数据支持clock以异染色质依赖但转录活性无关的方式抑制hMSC老化的观点。clock的过表达可能是衰老hMSCs恢复的新途径。clock对hMSC衰老的拮抗作用表明，clock过表达可能是衰老hMSCs恢复的新途径。慢病毒载体介导的clock异位表达缓解了复制性衰老hMSCs和hgps特异性hMSCs的衰老表型，SA- akt -gal阳性细胞百分比下降、克隆扩展能力提高和异染色质标记水平增加都证明了这一点(图6a f)。从一个92岁的个体和一个76岁的个体分离的初级hMSCs中，衰老社会表型因clock过表达而减弱(图6g, h)。这些数据共同表明，clock过表达可能逆转hMSC的衰老(图6i)。基于clock的基因治疗减弱小鼠衰老相关关节退化作者接下来评估慢病毒给药clock是否能缓解衰老相关综合征。关节退变是老年人中最常见的肌肉骨骼疾病，是衰老过程中致残的主要原因。年龄相关的软骨磨损至少部分归因于间充质祖细胞的衰老。衰老标记(如Cdkn1a和Cdkn2a)和免疫响应基因(如Il10和Cxcl10)调节而基因在软骨发育(如Col1a1和Col2a1)下调关节的老老鼠(15个月)相比,那些年轻的老鼠(1个月)。 
图7:时钟基因治疗减轻了年龄相关性骨关节炎 此外，作者观察到在生理衰老过程中，小鼠关节内clock的mRNA水平下调(图7a)。因此，衰老细胞的消除或再生可能是治疗年龄相关性关节变性的一种可能的治疗方法。为了评估这种可能性，作者将编码clock或Luc的慢病毒载体(作为对照)注射到18个月大(年龄)的小鼠的膝关节关节腔中，并在第一次注射后的8周进行补充。分别于首次注射后15周和16周进行运动能力分析，并进行微ct (micro-CT)扫描(图7b)。踏车实验表明，注射编码clock的慢病毒可以提高老龄小鼠的运动能力(图7c)。微ct和safranin O-fast绿色染色分析显示，clock处理小鼠关节腔软骨再生增强(图7d, e)。此外，在clock处理小鼠关节软骨表面观察到衰老标记物P16表达降低(图7f)。34,65个膝关节rna序列显示，在clock慢病毒载体的作用下，与免疫反应相关的基因(如Il10、Nfil3和Ankrd1)下调，与软骨发育相关的基因(如Col1a1、Col2a1和Runx2)上调(图7g)。 与这些结果相一致的是，RT-qPCR验证了衰老标志物Cdkn1a和Cdkn2a以及免疫应答相关基因的下调，以及参与软骨发育的基因的激活(图7h)。同时，表达clock的慢病毒给药的老年小鼠关节软骨表面H3K9me3水平增加，证实了clock通过稳定异染色质在衰老细胞再生中的非典型作用。此外，RNA-seq分析鉴定了一组与浓缩染色体、核异染色质、DNA包装复合物和染色质相关的基因，这些基因在注射慢病毒clock载体的老年小鼠关节中上调。综上所述，这些结果支持了clock对衰老细胞年轻化的保护作用，这可能为促进软骨再生和减轻年龄相关性关节退化的症状提供了治疗基础。 原文链接：https:///10.1038/s41422-020-0385-7
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