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电泳允许通过 SDS-PAGE 分离的蛋白质通过电泳转移从凝胶转移到膜上。在我们的蛋白质印迹指南的第 3 部分中，Jackson公司详细介绍了电印迹的过程以及对其成功至关重要的一些注意事项。 在通过 SDS-PAGE 进行电泳之后，通过电泳转移将分离的蛋白质从凝胶上电印迹到膜上。聚丙烯酰胺凝胶和转移膜在被夹在负电J（阴J）和正电J（阳J）之间之前直接接触。 阴J放置在凝胶后面，阳J放置在膜后面。当施加电压时，蛋白质从凝胶迁移到膜，在那里它们被固定。结果是膜上凝胶图案的镜像。然后在免疫检测之前封闭印迹（电印迹膜）。
图：使用电印迹槽将蛋白质从 SDS-PAGE 凝胶转移到膜上。 膜可由硝酸纤维素或聚偏二氟乙烯 (PVDF) 制成。 硝酸纤维素 硝酸纤维素膜是非疏水性的，被认为通过非共价力与蛋白质相互作用——静电和疏水特性。 硝酸纤维素很容易水合，并为大多数检测方法提供低背景信号。 然而，硝酸纤维素膜在干燥后会变脆，如果要进行替代蛋白质的剥离和重新检测，则难以处理。 聚偏氟乙烯 PVDF 膜具有化学惰性，比硝酸纤维素膜更坚固，便于剥离和重新探测替代蛋白质。PVDF 是疏水的，通过疏水和偶J相互作用与蛋白质相互作用。因此，与硝酸纤维素膜相比，它们可以形成更强的相互作用，使它们能够结合更多的蛋白质（~150 µg cm²）。 然而，更大的膜蛋白亲和力可能会增加膜与一抗和二抗相互作用的可能性，从而增加背景信号的可能性。 PVDF 可能会自发荧光，如果要进行荧光检测以避免背景信号，则必须使用低荧光 PVDF 膜。由于 PVDF 的疏水性，膜在印迹之前需要在甲醇中“润湿”。这使缓冲液能够渗透基质并使蛋白质与膜结合。 Jackson公司：Western Blotting 转移步骤中需要考虑的因素 毛孔大小 如果感兴趣的蛋白质特别小或特别大，则可能需要考虑膜孔径。 较大的孔允许更大范围的蛋白质尺寸，但会增加小蛋白质在转移过程中穿过膜的风险。 而较小的孔提供更大的结合表面，增加结合能力并减少小蛋白质通过膜的机会。结合孔径大小，应考虑蛋白质浓度。 虽然膜和蛋白质之间的高结合亲和力确保了足够的蛋白质结合以进行准确的分析/检测，但在高蛋白质浓度下，这可能导致蛋白质-蛋白质自结合而不是蛋白质-膜相互作用，并在洗涤步骤中导致蛋白质损失。 洗涤步骤 SDS 可以抑制蛋白质转移到膜上，因此聚丙烯酰胺凝胶可以用去离子水洗涤，然后放入转移缓冲液中 15-30 分钟以与缓冲液平衡。 然而，在此过程中，小蛋白可能会从凝胶中迁移出来，因此在执行洗涤步骤之前应仔细考虑。怀疑样品含有具有许多疏水性氨基酸或高分子量的蛋白质，可以使用具有低浓度 SDS（0.02 至 0.1%）的转移缓冲液来防止其沉淀。 缓冲液 pH 转移缓冲液保持高于蛋白质等电点的 pH 值，确保它们保持负电荷并向阳J迁移。 常见的转移缓冲液使用 Towbin 系统（192 mM 甘氨酸、25 mM Tris、20% 甲醇）。这种低离子强度缓冲液的 pH 值为 8.3，高于大多数蛋白质的等电点。 除了盐的类型和浓度，添加酸性或碱性溶液来调节 pH 值会影响离子含量，从而影响缓冲液的电导率。 高离子水平会导致运行温度升高，这可能会导致转移效率低下并增加不良伪影的可能性。 添加甲醇 可以将甲醇 (MeOH) 添加到转移缓冲液中以提高蛋白质膜转移效率。添加 MeOH 可能会导致凝胶收缩，增加凝胶密度并延缓迁移，特别是对于高分子量蛋白质。 为了防止这种情况，凝胶在增加体积的甲醇中平衡，直到达到所需的浓度。 建议使用分析级 MeOH，因为较低级别的甲醇可能含有金属杂质，会损坏仪器，因此应避免使用。 应在使用前添加 MeOH，以防止缓冲液变质或溶剂蒸发。 电压 组装好凝胶膜夹层后，将盒子放入缓冲液罐中，并施加电压以驱动蛋白质从凝胶转移到膜上。 施加电压的电压强度和周期会影响蛋白质转移的效率，必须针对每个系统进行优化。 短时间的低电压会导致不完全转移，而长时间的高电压会加热系统，导致不正确的转移。 高电压也可能导致小蛋白质通过膜而不结合。这可以通过在个膜后面放置一个额外的膜来捕获这些多肽来观察。 理想情况下，应优化条件以确保所分析的所有大小的蛋白质都能令人满意地转移。 |
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