|
裂解和溶解： 为了使蛋白质能够进入分离凝胶，它们必须是可溶的形式。样品制备的阶段是裂解。 通过裂解提取细胞内表达的蛋白质，裂解会破坏细胞的质膜和/或细胞壁，以释放蛋白质。细胞外表达（分泌）的蛋白质不需要裂解，尽管可以对细胞进行处理和加载以观察由于合成不当而捕获的任何蛋白质。 Jackson公司大规模蛋白质纯化——提取方法： 可以通过蛋白质印迹分析来自各种来源的蛋白质。样品可能来自蛋白质表达系统，例如哺乳动物或细菌细胞培养物，或来自临床组织样品，每种都需要不同的处理来产生有用的印迹。 用于蛋白质提取的方法取决于样品的性质。蛋白质表达在哺乳动物、昆虫、细菌和酵母等不同类型的细胞中进行，一些样本可能来自组织；这些具有需要不同处理的结构特性。 分泌蛋白： 在哺乳动物或昆虫细胞系统中表达的一些蛋白质也可能在上清液中表达，不需要从细胞中提取。一个好的提示是保留上清液样本，并在筛选表达时将其加载到细胞裂解液旁边的凝胶上。 Jackson公司筛选和处理： 蛋白质表达通常通过蛋白质印迹进行筛选。例如，几个克隆的表达可以相互比较，或者它们在不同表达系统中的表达。在这些筛选试验中，从蛋白质制备物中取出样品并上样用于分析。通常这会将上清液与细胞沉淀进行比较，以定位表达发生的位置。考马斯染色观察到的总蛋白质可以与蛋白质印迹中特异性提取的感兴趣蛋白质的表达进行比较。 筛选试验中进行的基本处理可能不能代表最终表达（prep）是如何处理以供最终使用的，例如晶体学试验所需的仔细纯化步骤。
图 1：在一系列细胞裂解物中检测 His 标签蛋白。以 100 ng 的浓度将 C 末端 His-Tagged 蛋白添加到细胞裂解物中。HEK 293、CHO、BL21大肠杆菌和 Sf9 昆虫细胞的细胞裂解物被还原并在 100°C 下煮沸 5 分钟，并以 9 μg/孔的速度加载到串联 SDS 凝胶中。 A. 蛋白质印迹。将凝胶电印迹到硝酸纤维素膜上，用 PBS/0.2% Tween 20 中的 5% BSA 封闭，并用 Jackson ImmunoResearch 的 HRP Rabbit Anti-His Tag ( 300-035-240 ) 以 1:20K 稀释度进行探测，并使用数字成像仪进行可视化。 B. 凝胶用考马斯染色。 Jackson公司裂解缓冲液： 裂解缓冲液的目的是破坏细胞膜以释放蛋白质。裂解缓冲液通常包括破坏细胞膜脂质双层并形成胶束的去污剂。有许多缓冲液配方已经过验证，可用于不同的细胞类型或蛋白质表达位置，例如含有去污剂的 RIPA 或 NP-40。材料的加工应在冰上进行，以尽量减少可能改变蛋白质的细胞成分的降解和变性。 蛋白酶及其抑制： 溶解方法，例如涉及对细胞进行机械破坏的过程，会导致细胞内蛋白酶的释放。这些蛋白酶可以消化和截断感兴趣的蛋白质，这可能会导致在印迹上观察到多个条带。 蛋白质对蛋白酶的敏感性取决于其氨基酸组成，细胞内蛋白质的抵抗力低于细胞表面或细胞外蛋白质。当被去污剂溶解时，膜蛋白特别容易被蛋白酶降解。生物信息学工具可用于提前预测蛋白质对蛋白水解的敏感性。蛋白酶抑制剂可用于防止蛋白水解；这些可以是化学和酶抑制剂的混合物，可以在添加到细胞或要储存蛋白质的缓冲液之前添加到裂解缓冲液中。 有一系列抑制剂可以阻止常见的丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶以及氨肽酶和金属蛋白酶。不同的表达系统或对蛋白质活性抑制的敏感性可能会阻止某些抑制剂的使用。蛋白酶抑制剂的专有混合物通常是可用的，或者可以使用单一试剂。 可以在缓冲液中小心使用叠氮化物以防止细菌生长，细菌也可能是蛋白酶的来源。细胞裂解后可能会发生去磷酸化。如果磷酸化蛋白质是蛋白质印迹的目标，则磷酸酶抑制剂（如钒酸钠）也应添加到裂解缓冲液中。在整个样品制备过程中，样品应保持在冰上，以尽量减少降解和去磷酸化的可能性。（表1） |
|
|
