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编译：微科盟R.A，编辑：微科盟居居、江舜尧。
微科盟原创微文，欢迎转发转载，转载须注明来源《微生态》公众号。 导读肠道是控制人体健康的基础。肠上皮细胞和免疫细胞持续接触数以百万计的微生物，这些微生物对肠上皮屏障和免疫功能有很大的影响。肠道菌群现在被认为是人类的重要伙伴，积极促进肠道和远端器官的基本功能。在肠道生态系统中，微生物群与宿主之间的双向通讯不涉及直接的细胞接触。微生物和宿主来源的胞外囊泡(EVs)是这种跨界相互作用的关键参与者。越来越多的证据表明，细菌分泌的囊泡通过向宿主细胞运输和传递调节宿主信号通路和细胞过程的效应分子来介导菌群功能。因此，肠道微生物群释放的囊泡可能对健康和疾病有很大的影响。本文回顾了当前关于肠道微生物群EVs的知识，并特别强调了它们在控制宿主代谢、肠道屏障完整性和免疫训练中的作用。 原名：Microbiota-derived
extracellular vesicles in inter kingdom communication in the gut 译名：微生物来源的胞外囊泡在肠道内界间通讯中的作用
期刊：Journal
of Extracellular Vesicles
IF：17.337
发表时间：2021.11
通讯作者：Laura
Baldomà
通讯作者单位：西班牙巴塞罗那大学
DOI号：10.1002/jev2.12161
1 引言 2 细菌胞外囊泡(BEVs) 3 BEVs与哺乳动物宿主细胞的相互作用 4 肠道菌群对肠道内稳态的贡献 5 BEVs在肠道上皮中的转运 6 总结 人体的皮肤和粘膜表面定居着大量的微生物，统称为微生物组。在肠道中，定殖特别重要，就结肠中的微生物种群数量来说，每克粪便(湿重)中的微生物数量超过1011个。肠道微生物，称为肠道微生物群落，主要由细菌组成，但也包括古菌、真菌和病毒。总体而言，肠道微生物群贡献了超过300万个基因，这远远超过并补充了人类基因组编码的遗传信息。事实上，因微生物群编码的产物积极地对宿主许多基本的功能发挥作用，肠道微生物群被认为是一个“隐形的器官”。除了在营养、代谢和能量生产中的作用，对病原体和其他损伤引起的炎症反应中，肠道微生物群还具有调节免疫内稳态的作用。肠道微生物群在胃肠道免疫系统发育中的关键作用已在无菌小鼠模型中得到证实。当肠道微生物群失调时，无菌动物表现出免疫功能受损，并伴有萎缩淋巴器官和免疫球蛋白A(IgA)减少，而这时宿主更容易发生感染和过敏反应等病症。肠道微生物群与宿主肠粘膜细胞建立了复杂的、动态的、双向的联系。由于肠道屏障的结构，它们之间的相互作用不涉及直接的细胞接触。肠上皮粘液层产生了一种物理隔离，阻止腔内细菌进入肠道上皮细胞。在结肠中，分泌的粘液、凝胶形成的粘蛋白2形成一个明确界定的分层，分成两个层。内层高度致密，物理上隔离腔内细菌。此外，内粘液层含有由上皮细胞和免疫细胞分泌的抗菌肽和免疫效应物，它们的靶标是肠腔细菌。这有助于宿主-细菌的空间隔离。外层粘液层是松散的，提供了大量细菌在肠道内的粘附和定植部位。这一外层被肠道微生物群中的特定细菌降解。因此，它需要不断更新以保持完整和健康的内粘液层。作为对共生或机械降解的反应，杯状细胞产生粘蛋白2的过程可通过toll样受体(TLR)信号通路上调。由于微生物进入肠道上皮的途径因物理和化学隔离受到限制，与宿主的通讯主要依赖于微生物分泌物，如代谢物、蛋白质和胞外囊泡(EVs)，这些因子可以通过粘蛋白层到达肠道黏膜表面的宿主细胞。本文就微生物分泌的EVs及其在肠道中作为细菌-宿主相互作用的关键介质的作用进行综述。在接下来的章节中，我们将讨论它们作为调节肠道内稳态和人体健康的重要功能的信号所发挥的作用。1967年在霍乱弧菌中发现了细菌产生EVs。对数生长细菌细胞的电子显微镜分析显示，挤压细菌外膜产生球形膜结合结构的释放。这些结构的产生被视为是一种毒素分泌机制。最初，这些囊泡状颗粒被认为是不必要的结构。然而，随着研究的深入，这些囊泡作为细菌细胞生理和通讯的一种活跃的、调节的基本机制得到了认可。由于它们的起源，这些小泡被命名为膜囊泡。近几十年来，人们对其生物发生机制、组成和功能进行了深入的研究。众所周知，所有的细菌都会释放EVs作为物种间交流的一种机制。细菌胞外囊泡(BEVs)由革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌产生，是细菌分子的天然载体。BEVs的组成和含量来源于生产菌株，并因生长阶段和条件的不同而有所不同。目前，科学家们假设：囊泡的载体决定了它们的功能。对大量细菌进行的研究表明，革兰氏阴性菌产生不同种类的细菌胞外囊泡。主要类型来自外膜，被称为“外膜囊泡”(OMVs)。OMVs是由外膜囊的外单层和磷脂内单层组成的球形颗粒。它们起源于外膜起泡，因此富集在外膜和周质生物分子中。此外，在革兰氏阴性细菌中观察到被称为“外-内膜囊泡” (O-IMVs)的囊泡。这些囊泡会同时作为外膜和细胞膜而发挥作用。除了周质组分，它们还包括内膜蛋白和胞质分子。假设大多数革兰氏阴性菌同时产生两种囊泡，即OMVs和O-IMVs。最近的研究描述了一种新型的革兰氏阴性细菌来源的囊泡，称为“破裂性外膜囊泡”(E-OMVs)。这个基于噬菌体编码的内溶素诱导细胞裂解的模型，可以解释为什么OMVs也含有DNA和胞浆蛋白。与革兰氏阴性细菌不同，革兰氏阳性细菌的细胞壁由一层厚而坚硬的肽聚糖外层组成，这层肽聚糖最初被认为可以阻止细菌胞外膜囊泡的释放。多年来，革兰氏阳性菌BEVs的研究一直被忽视。这个领域在过去十年里才得到更多的关注。多种革兰氏阳性物种，如：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的研究证实，革兰氏阳性菌产生的BEVs也是直径为20-100纳米的球形膜颗粒。由于缺乏外膜，革兰氏阳性菌的(EVs)被命名为“细胞质膜囊泡”。来自革兰氏阳性细菌的BEVs缺乏外膜囊和周质组分，但携带类似于革兰氏阴性细菌EVs的载体分子，包括肽聚糖、脂类、蛋白质和核酸。为了简化命名，我们将在下文用术语BEVs来指代所有类型的细菌来源的囊泡，除非特别强调适用于特定细菌胞外囊泡的子类囊泡(例如：OMVs或CMVs)。尽管BEVs具有重要的生物学意义，但我们对其生物发生的机制仍然知之甚少。根据最新的发现，科学家们已经提出了BEVs生物发生的一些模型。对于革兰氏阴性细菌，最初的研究表明，BEVs是在自然条件下产生的并且是与细菌细胞壁更新有关的副产物。在细胞壁回收过程中，失去外膜和肽聚糖之间的相互作用导致外膜出芽和随后释放OMVs。BEVs在应力条件下也会脱落。一种模型是基于由于肽聚糖片段或周质中错误折叠的蛋白质的积累而引起的物理应力，这种应力导致膨胀压力的增加，从而导致外膜膨出。这个模型支持了这样的观点，即：OMVs的形成可能是一种有益的废弃机制，以去除过量的有害蛋白质。此外，抗生素环丙沙星引起的Stenotrophomonas maltophilia应激促进了其他物种的BEVs，包括OMVs和O-IMVs释放的增加。第三个模型涉及LPS对外部因素的结构性变化。高电负性的LPS的阳离子浓度的变化可能导致局部负电荷的积累和LPS分子之间的排斥，从而导致细菌细胞膜的局部变形和囊泡脱落。将假单胞菌喹诺酮信号(PQS)插入外膜的外小叶可通过这种机制增加膜曲率和OMVs的形成。其他影响LPS重构的其他因素也会导致外膜曲率和OMVs形成的改变。LPS通过一种称为脂质A的酰基化双糖固定在外膜的外小叶上。在肠道沙门氏菌血清型胸腺瘤中，脂质A的去酰基化导致高囊泡化和OMV的产生。相比之下，pagL突变体在催化脂质A去酰化的酶中有缺陷，与野生型菌株相比OMVs释放量显著减少。最近的研究表明，所有生长条件下磷脂在外膜的内部和外部小叶之间的不对称分布是OMVs形成的一般机制。事实上，突变的磷脂转运蛋白VacJ/Yrb显示高产囊泡的表型。这是由于磷脂在外膜的外层单张中积累，引发了不对称膨胀、膜膨胀和随后的OMVs释放。这个涉及VacJ/YrbABC转运系统的机制由革兰氏阴性细菌中铁的可利用性来调节。在这个模型中，细胞裂解由噬菌体编码的内溶素所触发，内溶素降解肽聚糖细胞壁。一旦肽聚糖被降解，细胞聚集并破裂。破碎的薄膜碎片聚集起来并组装成E-OMVs。革兰氏阳性细菌BEVs的生物发生起源尚不清楚。早期的研究表明，囊泡可能是通过孔隙在细胞壁的膨胀压力，从细胞膜出芽而生成。然而，目前的模型涉及到肽聚糖降解酶的机制，类似于铜绿假单胞菌所描述的破裂性细胞裂解。这一机制在用丝裂霉素C处理枯草杆菌这一实验中可得到证实。这种抗生素药物引起基因毒性应激，导致激活由整合在细菌染色体上的前噬菌体编码的内溶素。随后肽聚糖的降解导致细胞通过肽聚糖层的孔突出细胞质物质，使CMVs释放。铜绿假单胞菌细胞聚集破裂，而枯草芽孢杆菌来源的CMVs通过细胞壁上形成的孔隙释放。此外，最近一项对金黄色葡萄球菌的研究表明，这种细菌产生的蛋白质，如苯酚可溶性调节素和自溶素，可增加细胞膜的流动性，促进CMVs的形成。同样，抗生素在金黄色葡萄球菌中诱导的氧化应激通过独立于噬菌体的方式增加肽聚糖层的渗透性而触发CMVs的产生。除了酶控制革兰氏阳性细菌产生巨细胞病毒外，科学家们还研究了囊胚形成的遗传调控机制。单核细胞增生李斯特菌的基因编码因子σB(sigB)或产脓链球菌的双组分系统CovRS的中断导致巨细胞病毒的产生改变，从而引发囊泡生物发生中的调控。BEVs一旦被释放就会调节细胞之间的通信，其效果取决于它们的载体。BEVs的物质组成受所生产的菌种类型、生长和环境条件以及生物发生机制的影响。载体分子的多样性赋予BEVs在细菌-细菌和细菌-宿主相互作用中的关键作用。许多研究表明，某些蛋白质和脂质被选择性地整合到BEVs中。然而，这些分子是如何被挑选出来的仍然是个未知数。在这种背景下，预先形成的外膜微区的机制可以用来解释BEVs中某些蛋白质的富集差异。在本节中，我们从蛋白质、脂质、核酸和小分子方面概述了关于BEVs组成的一般信息。BEVs的蛋白质含量并不完全相同，取决于亲代细菌。基于蛋白质组学方法的研究已经确定了与许多生物过程相关的蛋白质，这些蛋白质根据它们的功能分为六类：结构蛋白、孔蛋白、离子通道、转运蛋白、酶和与应激反应相关的蛋白质。从这些研究中，我们了解到革兰氏阴性菌释放的BEVs富含外膜蛋白，如OmpA、OmpC和OmpF，以及周质蛋白如AcrA和碱性磷酸酶。来自不同革兰氏阴性病原体的BEVs的蛋白质组学分析揭示了毒力因子以及大量参与生物膜形成、致病性和宿主-细胞相互作用的蛋白质的存在。在Salmonella enterica serovar
thyphymurium中也发现了参与囊泡生物发生或调控囊泡大小、产量和载体的蛋白质。对革兰氏阴性益生菌和共生菌释放的囊泡的蛋白质组学研究表明，囊泡中含有促进菌株在肠道定植、竞争和细菌存活以及调节宿主免疫和防御反应的蛋白质。一些鉴定出的蛋白质是菌株特异性的。有趣的是，益生菌Escherichia coli Nissle 1917(EcN)释放的BEV的蛋白质组学分析确定了一组由革兰氏阴性病原体分泌的BEV共有的蛋白质。这些是兼职蛋白质，根据细胞位置发挥不同的功能。此外，该研究还揭示了由菌株特异性基因编码的蛋白质，其中大多数是有助于细菌在有害的肠道环境中生长和存活的粘附素和适应因子。对于革兰氏阳性细菌的BEVs，不同种类细菌(金黄色葡萄球菌、化脓性葡萄球菌、肺炎链球菌、炭疽杆菌等)的蛋白质组学分析确定了与多种生物学过程相关的膜蛋白和细胞质蛋白。最近的研究表明，从几种革兰氏阳性益生菌转运蛋白中分离出的CMVs转运蛋白在免疫调节和宿主相互作用中起到有益作用。脂质是细菌细胞膜的重要结构组成部分，来自革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的相应BEVs分别是OMVs和CMVs。一直以来，外膜磷脂都存在于OMVs中。然而，有证据表明OMVs包含一些在细菌外膜中没有发现的脂质。在大肠杆菌中的研究表明，OMVs包括参与膜折叠的脂质，如甘油磷脂、磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺和心磷脂。脂肪酸结构影响脂膜的流动性和刚性。在铜绿假单胞菌中，饱和脂肪酸的相对含量比细胞外膜高1.5倍左右，这一事实与细胞膜刚度有关。相反，在革兰氏阳性A组链球菌菌株中存在饱和脂肪酸。LPS是细菌OMVs的一般组成部分，尽管囊泡和细菌外膜之间的LPS组成可能存在差异。在这种情况下，有报道称与细胞壁相比，Porphyromonas gingivalis OMVs携带有长糖链和脱酰基脂质A的LPS分子。同样，脱酰基脂质A在沙门氏菌OMVs中积累。在革兰氏阳性细菌中，脂质组学研究显示CMVs和质膜保留了一些重要方面，但在某些脂质和脂蛋白上表现出一些差异。在炭疽杆菌和肺炎链球菌中，囊泡富含C12-C16链饱和脂肪酸。相反，在单核细胞增生李斯特菌衍生的囊泡中比在细菌细胞中含有更为丰富的不饱和脂肪的脂质。此外，来自这种病原体的CMVs富含磷脂酰乙醇胺、鞘脂和三酰基甘油，但甘油三酯的代表性不足。总体而言，这些研究表明CMVs的脂质组成可能因细菌种类而异。这些差异可能与某些生态位中的细菌适应和生存有关。许多研究表明，革兰氏阴性和革兰氏阳性来源的BEVs载有核酸，包括DNA和RNA。因此，BEVs允许将DNA导入其他细菌细胞，从而调节基因水平转移。此外，BEVs促进转运的核酸与宿主细胞内特定受体的相互作用，从而触发宿主免疫反应的调节。在来自铜绿假单胞菌的BEVs中，大多数DNA携带与抗生素抗药性、毒力和应激反应有关的特定功能的基因。在革兰氏阳性产气荚膜梭菌中，BEVs携带编码细菌毒素的基因，如：α-毒素基因(plc)和产气荚膜溶素O(pfoA)。变形链球菌BEVs的外源DNA主要与生物膜的形成和成熟有关。以上这些是细菌粘附过程中的基本过程。除了DNA，一些研究已经表明在BEVs中存在RNA，这对于调节宿主免疫系统和其他细胞过程具有重要意义。与BEVs相关的RNA受到保护而不被降解，从而促进了其向真核靶细胞的转运。与BEVs相关的RNA编辑已经发表。这些研究表明BEVs中的RNA富集在小的非编码RNA中，这些RNA主要参与基因转录后表达的调控。在某些情况下，RNA载体可诱导靶细胞的表型改变。在某些病原菌中，通过BEVs分泌的小RNA介导宿主免疫反应失调。此外，在大肠杆菌BEVs中发现的许多转运的小型非编码RNA序列与与表观遗传机制(染色质重构，组蛋白修饰)或细胞特异性转录控制相关的基因表达调控相关的人类基因组区域对齐。有研究表明，BEVs相关的小RNA具有类似于真核miRNAs的调节作用。BEVs还载有调节靶细胞功能的代谢物和效应分子。代谢组学研究表明，BEVs含有代谢物，这些代谢物根据生产菌株选择性包装。在多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)中，从致病或共生菌株中分离出的BEVs之间代谢物含量的变化与各菌株在肠道定殖和生存的能力相一致。BEVs包装的其他效应物也作为适应因子，帮助细菌在特定的生态位中生存。例如，来自脆弱拟杆菌的BEVs载有抗菌肽BSAP，该肽对人类肠道中的其他拟杆菌目表现出抑制活性。BEVs还可作为载体分泌疏水性群体感应分子，介导细菌群落中的通讯，控制如毒性或生物膜形成等重要过程。分泌BEVs是一个昂贵的过程，需要能量消耗。这种分泌机制是通过进化选择的，因为BEVs具有重要作用，可以给予细菌自我保护或促进与微生物群落或宿主的其他成员的相互作用和通讯。BEVs参与了许多生物过程，这可能根据它们的特定载体而有所不同。BEVs的功能可分为两类：与细菌-细菌相互作用相关的功能和与细菌-宿主通讯相关的功能。关于细菌-细菌之间的相互作用，BEVs通过帮助、竞争或者杀死其他细菌，使生产细菌在生态位中生存下来。在这种情况下，BEVs可以作为一种微生物防御机制，提供保护功能，对抗包括噬菌体、抗生素、活性氧和抗菌肽在内的有害物质。释放的BEVs可以隔离噬菌体，使他们不直接与细菌细胞相互作用，防止有害影响。BEVs也可作为针对细菌膜的污染物或抗生素的诱饵。除了作为抗生素靶标的被动作用外，BEVs还释放赋予抗生素耐药性的酶，这有利于微生物群落中的生产菌株和其他敏感细菌。在这种背景下，在金黄色葡萄球菌和拟杆菌的BEVs中发现了β-内酰胺酶。β-内酰胺酶基因已在BEVs中发现。在这种情况下，BEVs允许物种内和物种间水平转移编码抗生素耐药性的基因。此外，BEVs还具有代谢优势。铁载体、氨基酸或脂肪酸运输系统的存在促进了营养物质的获取和细菌的存活，并可能作为一种对抗其他细菌的竞争机制。BEVs还可以携带水解酶，催化降解环境中存在的蛋白质和复杂多糖。这可能有助于微生物群落获取营养物质。BEVs除了对细菌群落有益外，还可以发挥攻击性功能。在这个意义上，它们携带降解酶，如胞壁质水解酶、肽聚糖水解酶或内肽酶来杀死竞争的细菌。来自某些粘球菌属的BEVs已被证明含有具有抗菌活性的因子和大量引起目标细菌细胞溶解的水解酶，因此给生产菌株赋予了捕食活性。在微生物群落中，BEVs在细胞间通讯中起着关键作用。如上所述，BEVs中分泌的疏水群体感应分子可以根据种群密度协调细菌的生长和行为。群体感应分子也驱动微生物群落在生物膜中生长。有证据表明，BEVs是由多糖、脂类、核酸和蛋白质组成的生物膜基质的重要组成部分。生物膜的形成保护多种细菌群落，并有利于营养物质的获取和菌株的存活。在这种情况下，BEVs可以对这些功能做出贡献。在细菌-宿主相互作用的背景下，BEVs很好地适应了环境，并成为跨界通讯的必要条件。有证据表明，它们通过向靶细胞输送细菌效应物来控制宿主细胞的通路和过程。BEVs具有粘附素类分子，帮助其粘附于宿主细胞，而免疫受体识别的微生物分子参与激活炎症反应和防御反应。在病原体中，BEVs携带毒力因子、毒素和免疫调节效应物，帮助细菌攻击宿主细胞并破坏宿主机制，从而逃避免疫系统。对于与宿主建立共生关系的菌株，释放的BEVs作为调节重要宿主功能的细菌介质的传递机制。此外，基于其作为远程运输工具的特性以及其固有的多功能性和生物相容性，BEVs正被探索成为有前景的新型治疗方法。目前，科学家们正在开发基因工程BEVs，作为新的疫苗和佐剂或专门的药物输送载体，用于治疗新出现的和新的疾病。来自革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌产生的BEVs可以将其内容物输送到宿主细胞的细胞质中。哺乳动物宿主细胞摄取BEVs主要通过内吞作用进行。这一过程通过不同的途径发生，取决于囊泡的表面和载体。吞噬作用是免疫系统吞噬细胞(中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞)内化BEVs的主要途径。大多数关于哺乳动物宿主细胞摄取BEVs机制的现有信息来自于针对革兰氏阴性病原体的研究。首次对微生物群源性BEVs的研究集中在益生菌EcN和共生大肠杆菌菌株。研究表明，来自肠道大肠杆菌菌株的BEVs主要通过网格蛋白介导的内吞作用被几个上皮细胞系内化。内化的BEVs始终与网格蛋白和核内体和溶酶体的特异性标志物共定位。特异性抑制剂对脂筏和小泡结构域的破坏并不影响囊泡的摄取。此外，从一个大肠杆菌(EcN)tolR突变体中分离的BEVs的低温透射电子显微镜分析证明，分离的囊泡中存在高度的结构异质性，存在与常见OMVs或O-IMVs不相符的异常结构。该研究表明，tolR突变体的BEVs表现出细胞结合能力下降，从而对Caco-2细胞摄取水平产生负面影响。这表明只有传统的(BEVs)可以通过网格蛋白介导的内吞作用有效地进入上皮细胞。最近的一项研究揭示了从常驻肠道微生物B. thetaiotaomicron中摄取和运输BEVs的机制。作者通过体外培养的方法发现，多形拟杆菌BEVs主要通过依赖于动力蛋白的内吞作用被肠上皮细胞(IECs)内化，并被内溶酶体囊泡分选。此外，体内成像研究表明，一部分多形拟杆菌BEVs通过细胞旁迁移穿过肠上皮并到达全身循环。这表明BEVs介导与肠外组织的长距离通讯。关于革兰氏阳性菌的BEVs的内化途径的研究很少。在益生菌Lactiplantibacillus plantarum BGAN8中，在存在内吞途径特异性抑制剂的情况下进行的时间过程内化实验证明，IECs中分泌囊泡的主要进入途径是网格蛋白介导的途径，虽然其摄取动力学比报道的革兰氏阴性益生菌的BEVs慢。大肠杆菌BEVs在15-30分钟的培养时有明显的内化，而检测细胞内的植物乳杆菌BEVs则需要1h以上。作者认为，这种益生菌所分泌的丰富的胞外多糖物质，伴随着分离的BEVs，可以引起诱捕效应，延缓BEVs与上皮细胞膜结构的相互作用，以实现内吞作用。其他内部机制可能并行运作，取决于囊泡的大小。捕获BEVs的胞外多糖可为从该益生菌培养物中分离出来的BEVs形成大量的包膜，可被微胞吞作用吸收。BEVs含有亲本菌株产生的生物成分。在这种情况下，介导与宿主细胞外蛋白或特定细胞受体粘附的表面载体分子是与靶细胞主要相互作用的决定因素，因此也会产生衍生效应。BEVs还携带一组被称为微生物相关分子模式(MAMPs)的分子，这些分子被宿主上皮细胞和免疫细胞表达的特异性受体识别。这些模式识别受体(PRRs)是先天免疫的关键组成部分，因为它们感知肠道微生物并介导适当的反应。哺乳动物细胞根据其位置和与细胞膜的关联表达不同类型的PRRs。TLRs是可位于质膜(TLR2、TLR4、TLR5)或细胞内体膜(TLR3、TLR7、TLR9)的跨膜蛋白，存在于BEVs表面的MAMPS(胞外多糖、脂多糖和脂蛋白)可以结合胞外TLRs激活参与免疫和防御反应调节的细胞信号通路。此外，BEVs通过内吞途径被哺乳动物宿主细胞内化。通过这种机制，BEVs允许细胞内传递其他封闭的MAMPs，如DNA或RNA，这些被内吞区膜上的特定TLR受体识别。细胞内存在细胞溶素免疫受体(与细胞器膜无关)，如核苷酸结合寡聚结构域蛋白1(NOD1)和NOD2，它们被细菌肽聚糖片段激活。在非侵袭性革兰氏阴性病原体中，内化的BEVs是在宿主细胞内传递肽聚糖和随后激活NOD受体的一种机制。有关幽门螺杆菌的研究表明，NOD1与内吞囊泡中的肽聚糖的相互作用发生在早期的核内体，NOD1在BEVs的细胞内运输过程中被募集。这些受体与肽聚糖结合后，通过激活核因子-kB(NF-kB)或丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路启动炎症反应，最终上调炎症基因的转录(图1)。这一机制也被微生物群大肠杆菌株释放的BEVs激活。
图1 宿主免疫受体对BEVs相关分子模式的识别。展示了位于宿主细胞膜(TLR1/6，TLR2，TLR4，TLR5)，位于核内体膜(TLR3，TLR7/8，TLR9)和胞质NODs(NOD1/NOD2)的toll样受体(TLRs)，以及导致NF-kB激活的下游信号通路。不同信号传导通路的蛋白质被绘制成彩色椭圆。与每个受体特异性相互作用的分子相关模式用红色表示。在过去20年中，许多研究集中在革兰氏阴性病原体的BEVs上，因为它们作为传递毒性因子和分子的载体，抑制和逃避宿主的免疫反应。益生菌和肠道微生物衍生囊泡的研究开始于2010年代。从那时起，大多数的研究都集中在革兰氏阴性共生菌，特别是脆弱拟杆菌、多形拟杆菌、嗜粘蛋白艾克曼氏菌和益生菌大肠杆菌菌株EcN。革兰氏阳性肠道微生物的BEVs研究起步较晚，主要集中在乳杆菌属和双歧杆菌属的益生菌。在本节中，我们回顾了BEVs作为肠道菌群影响肠道内稳态的重要角色的现有研究。我们重点关注微生物BEVs如何控制食物代谢、肠上皮屏障完整性和免疫反应。表1总结了本节提供的信息。 表1 评估微生物BEVs作为肠道内稳态相关过程调节剂作用的研究。
肠道微生物群在肠粘膜与宿主保持共生关系，并为健康个体提供重要的代谢、免疫和肠道保护功能。微生物群的一个重要功能是产生影响微生物和宿主的代谢物。肠道微生物中最丰富的一个门是拟杆菌门，它利用多种生物化学机制在肠道恶劣环境中定植。这些共生细菌在糖代谢和短链脂肪酸生产中的作用得到了充分研究，这些短链脂肪酸为宿主提供日常所需的能量。特别是，多形拟杆菌是研究共生细菌与宿主相互作用的一个很好的模型，因为它在复杂的糖代谢中有明确的作用，且已获得它的完整基因组。多形拟杆菌编码几种粘蛋白降解酶，如糖基水解酶和硫酸酯酶，这些酶可以同化粘蛋白聚糖和膳食营养物质，因此比其他细菌具有适应性优势。一些分解产物可以被肠道微生物群的其他成分用作营养来源。这有利于建立一个平衡的微生物共生群落。重要的是，细菌对复杂碳水化合物的代谢活动产生了SCFAs池，这些SCFAs通过大肠被重新吸收，并被宿主用作能量来源，提供了大量的日常能量需求。拟杆菌产生的BEVs是这种酶活性的来源，对宿主代谢有很大的影响。大多数研究都是针对多形拟杆菌和脆弱拟杆菌进行的。脆弱拟杆菌是一种良好的肠道定植菌。事实上，它通常是从健康的人类粪便中分离出来的。来源于多形拟杆菌的BEVs含有帮助肠道多糖消化的酶。蔬菜中存在的磷酸肌醇(InsP6)通过螯合二价阳离子干扰多糖消化。由于人类IECs不表达能使InsP6去磷酸化的酶，该活性依赖于肠道菌群编码的酶。此外，在拟杆菌来源的BEVs中发现了多种水解酶，如糖苷酶、硫酸酯酶和蛋白酶，它们参与分解宿主难消化的聚糖和粘蛋白。有证据表明，多形拟杆菌BEVs以硫酸酯酶依赖性方式内化于黏膜巨噬细胞。通过这种机制，BEVs可以穿过粘膜屏障，促进细菌抗原和因子向免疫细胞的传递。多种研究集中在拟杆菌BEVs和胆固醇代谢之间的联系上。棕榈酸酯等饱和脂肪酸能刺激多形拟杆菌和脆弱拟杆菌菌株产生BEVs。此外，来自上述两种细菌的BEVs均上调了介导肠上皮细胞摄取胆固醇的类Niemann-Pick C1转运因子的表达。代谢组学分析表明，来自拟杆菌属物种的(BEVs)在与宿主的相互作用中载有相关的代谢物。关于多形拟杆菌BEVs进行了计算机分析，预测了其代谢物的作用。这表明囊泡富含有助于肠道定植的代谢物，以及可纳入小鼠代谢途径的代谢物。对脆弱拟杆菌进行的研究显示，不同生产菌株BEVs的代谢组学和蛋白质组学含量存在显著差异。脆弱拟杆菌菌株可以通过其产生锌依赖的金属蛋白酶毒素(BTF)的能力来区分。它们分为非产肠毒素型脆弱拟杆菌(NTBF)和产肠毒素脆弱拟杆菌(ETBF)。ETBF菌株引起肠道炎症，在某些情况下可能导致结肠癌。毒素BTF通过BEVs作为表面暴露蛋白分泌。在这个位置，BTF通过疏水和静电相互作用与宿主细胞膜的磷脂和多糖相互作用。除了毒力因子，NTBF和ETBF菌株的BEVs的蛋白质组学和代谢组学分析表明，非致病菌株的BEVs富含多糖利用所需的酶，这种代谢活动对肠道生态有积极的贡献。相反，来自ETBF的BEVs含有大量的分解代谢酶，这些酶属于能量生成途径，可以在肠道中长期存在。用同位素标记葡萄糖进行的流体实验证实，这些通路在病原菌衍生的BEVs中是活跃的。
图2 与拟杆菌衍生BEVs相关的代谢活动有助于肠道生态和食物代谢。(a)指出了多形拟杆菌和脆弱拟杆菌BEVs中作为载体的酶对代谢的影响。(b)图中显示了肠上皮屏障和潜在的免疫系统。粘蛋白层(绿色)维持腔内微生物和肠上皮之间的分离。蓝色盒子将囊泡酶(红色)与每个特定功能连接起来。SCFAs：短链脂肪酸，InsP6：磷酸肌醇。在肠道中，除了宿主来源的EVs，微生物BEVs还起着上皮屏障完整性的调节作用。这种调节对肠道内稳态至关重要，因为破坏这种屏障会导致肠道通透性增强，从而引起炎症、过敏和代谢性疾病。肠道上皮起着物理屏障的作用，限制腔内微生物和抗原进入宿主组织，而不干扰离子通过细胞旁间隙。调控上皮屏障功能的一个重要机制是相邻IECs之间紧密连接(TJs)的形成。TJs通过跨膜蛋白(包括occludin、claudin、tricellulin和连接粘附分子)在极化上皮的顶端建立细胞间连接。这些蛋白通过胞质蛋白ZO-1和ZO-2锚定在肌动蛋白骨架上。肠道病原体会导致TJs紊乱，这是其感染机制的一部分，而某些菌群菌株会强化TJs结构，作为维持肠道屏障完整性的机制。除了TJs，IEC之间还有其他的连接结构，即粘附连接、缝隙连接和桥粒连接。肠道微生物种群的一些研究显示了微生物BEVs作为上皮屏障完整性的调节剂的作用。对于肠道大肠杆菌分离株，益生菌EcN因其公认的免疫调节和抗炎特性而被广泛研究，有助于微生物群平衡。益生菌EcN通过调节TJ蛋白ZO-1、ZO-2、claudin-14和桥粒蛋白pinin来加强上皮屏障。Hering及其同事的研究表明，触发claudin-14上调的益生菌因子是分泌蛋白TcpC，它激活ERK1/2信号通路。我们的研究包括其他肠源性大肠杆菌菌株，如ECOR12(A组;TcpC阴性)、ECOR63(B2组;TcpC阳性)。我们已经证明，大肠杆菌菌株释放的BEVs通过直接和间接机制以菌株特异性的方式调节上皮屏障的完整性。在结肠单层细胞系中，EcN和ECOR63产生的BEVs通过上调TJs蛋白ZO-1和claudin-14的表达来增强上皮屏障功能。此外，来自两个菌株的BEVs通过下调claudin-2来调节屏障通透性。这些调节活动不依赖于以游离可溶性蛋白形式分泌的TcpC。相反，ECOR12 BEVs对上皮屏障完整性没有影响。研究了EcN和ECOR63 (BEVs)在肠致病性大肠杆菌感染引起的上皮屏障功能障碍细胞模型中的保护作用。在这个模型中，两个大肠杆菌株的BEVs都能够通过激活影响TJs蛋白的转录和转录后水平的补偿性调控机制，保护上皮屏障的完整性免受EPEC感染。具体而言，BEVs抵消了occludin和claudin-14 mRNA表达的改变，保留了细胞边界TJs中的ZO-1和occludin，并改善了F-actin细胞骨架的破坏。在人体肠道中，上皮细胞和免疫细胞之间的相互作用对维持肠道内稳态至关重要。在此背景下，我们已经证明，肠道大肠杆菌菌株释放的BEVs激活肠粘膜中其他协同增强上皮屏障的机制(图3)。在人结肠外植体中，EcN BEVs激活IL-22的表达。这种细胞因子通过诱导杯状细胞产生粘蛋白来帮助保护上皮屏障的完整性。在实验性小鼠结肠炎模型中，EcN BEVs的口服给药保留了粘膜的结肠细胞结构，这种作用可能归因于三叶因子3(TFF3)的上调，这是一种参与上皮修复的生物活性肽。EcN BEVs的另一个屏障保护机制是下调基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达，这种酶通过扰乱IECs之间的TJs促进肠道炎症，进而导致肠道通透性增加和随后的促炎效应。微生物群多样性的减少，特别是革兰氏阴性细菌嗜粘蛋白艾克曼氏菌数量的减少，与炎症性肠病的发展有关。这种微生物是人体肠道中的大量共生菌，通过将肠粘蛋白降解为短链脂肪酸(SCFAs)来为宿主提供代谢利益。有趣的是，SCFAs也是控制食欲和进食的重要分子。此外，嗜粘蛋白艾克曼氏菌还有其他与肠道屏障增强和免疫调节相关的有益特性。与此一致的是，在接触葡聚糖硫酸钠(DSS)之前预先给小鼠注射嗜粘蛋白艾克曼氏菌可减轻结肠炎症。基于同一实验模型的研究表明，嗜粘蛋白艾克曼氏菌释放的BEVs介导了所观察到的保护作用。通过减少结肠组织中免疫细胞的浸润和促炎细胞因子的产生，口服给药分离的BEVs可以改善结肠炎症状。如上所述，上皮屏障破坏后肠道通透性增加，允许内毒素和管腔抗原进入肠固有层。这种交易引发了粘膜免疫反应，导致慢性轻度炎症，促进代谢紊乱，拥有属性非脂肪肝疾病和胰岛素抵抗，导致2型糖尿病，最终导致肥胖。宏基因组学分析显示，肥胖和2型糖尿病患者中嗜酸性黄曲霉的含量减少，而且他们的粪便样本中含有较少的嗜粘蛋白艾克曼氏菌来源的MVs。在高脂饮食(HFD)诱导的糖尿病小鼠模型中，研究了嗜粘蛋白艾克曼氏菌BEVs在调节肠道通透性中的作用，并与喂食正常饮食的对照组小鼠进行了比较。嗜粘蛋白艾克曼氏菌BEVs的口服给药改善了所有由HFD引起的改变，影响了肠道通透性和代谢功能。此外，细菌胞外囊泡(BEVs)恢复了肠道屏障，上调了改变的TJs蛋白封闭蛋白ZO-1和紧密连接蛋白-5。通过免疫印迹技术证实了嗜粘蛋白艾克曼氏菌BEVs occludin的转录激活作用，这种激活作用发生在受到LPS攻击的Caco-2单层细胞中。在代谢效应方面，经过处理的小鼠体重减轻，葡萄糖耐量增加。这些新陈代谢的结果归因于恢复了屏障的完整性，因为在给药后的6小时内，在结肠中发现了BEVs，但在肝脏、肌肉、脂肪组织、胰腺或脾脏中没有发现BEVs。其他的研究也证实了在喂食HFD小鼠时，来源于粘液分泌的BEVs的有益作用。他们可以减少体重增加，脂肪组织炎症，血糖和胆固醇水平。此外，接种粘膜嗜酸链球菌BEVs的动物表现出ZO-1、occludin-1和claudins-1的上调表达。有趣的是，嗜粘蛋白艾克曼氏菌BEVs比活细菌引起更强的效果。作者证实了人结肠直肠腺癌细胞株Caco-2中嗜粘蛋白艾克曼氏菌胞外囊泡(BEVs)上调ZO-1、ZO-2和claudins-4的表达。总的来说，这些研究指出了嗜粘蛋白艾克曼氏菌BEVs对炎症性疾病的治疗潜力，其作为肠道屏障完整性的积极调节因子，从而减轻炎症。
图3 微生物BEVs对肠上皮屏障的调节作用。肠上皮示意图，其中紧密连接(TJ)蛋白由连接相邻肠上皮细胞(IECs)的彩色条表示。大肠杆菌Nissle 1917 (EcN)和ECOR63(左图)或A.
muciniphila(右图)释放的BEVs通过内层黏液层迁移到上皮。下图显示了已知BEVs激活的影响肠屏障完整性的调节机制，以说明证据是从体外实验(IECs培养)还是肠道通透性增加的体内模型(实验性结肠炎和高脂饮食诱导的糖尿病模型)中获得的。红色箭头表示基因转录的上调/下调。对于每个实验模型，BEVs抵消疾病改变的有益作用用蓝色箭头表示。总体而言，微生物BEVs介导的调节作用导致肠上皮屏障加强和随后肠道通透性降低。本节讨论了共生菌和益生菌衍生的BEVs对调节宿主免疫反应的作用。我们在本部分将解释微生物BEVs通过肠上皮间接激活免疫细胞的机制，以及微生物BEVs与免疫细胞直接相互作用的机制。本节中描述的主要机制在图4中进行了总结。
图4 微生物BEVs对肠道免疫调节作用的示意图。该图显示肠上皮被黏蛋白层覆盖，阻止腔内微生物进入，同时允许BEVs通过。单层上皮下可见固有层的免疫细胞(淋巴细胞、巨噬细胞和树突状细胞)。微生物来源的BEVs通过两种主要机制发挥免疫调节作用。(i)通过肠上皮非直接激活免疫细胞(左图)。肠上皮细胞(IECs)内化EVs激活胞质受体NOD1，触发免疫效应因子的分泌，进而刺激肠道相关淋巴细胞产生多种细胞因子。微生物BEVs对NOD1信号通路的激活作了更详细地展示。BEVs通过网格蛋白介导的内吞作用被内化，并将NOD1(灰色圆柱体)募集到早期核内体。激活的NOD1与特异性激酶RIP2(红圈)相互作用，导致NF-kB的激活和随后参与炎症反应的宿主基因上调(IL-6，IL-8)。(ii)肠道微生物群BEVs直接激活肠道驻留免疫细胞，导致免疫介质和IgA的分泌(中间方案)。除了与微生物群BEVs的直接相互作用外，树突状细胞(DCs)还通过在上皮细胞层延伸伪足而与管腔BEVs相互作用(右图)。对几种肠道微生物的研究表明，BEVs以菌株特异性方式激活DCs。从益生菌和共生大肠杆菌中分离得到的BEVs具有特异性免疫调节作用，DCs中miRNAs的差异调节是其中的调节机制之一。综上，DCs整合微生物群BEVs传入的信号，并建立特定的程序，促进naïve T细胞分化为效应T细胞(Th1，Th2，Th17，Th22)或调节性T细胞(Treg)，从而协调适当的T细胞反应。共生细菌对免疫系统的调节已在体外细胞模型中进行了研究，该模型旨在模拟体内肠道中发生的情况。这些模型旨在重现肠道微生物群、肠道上皮细胞和免疫系统之间的相互作用，并由上皮细胞和免疫细胞在Transwell装置中共培养组成。人类单层IECs生长在模拟肠上皮屏障的上腔，在模拟固有层底层免疫系统的基底侧腔培养未成熟的树突状细胞(或其他免疫细胞)。在该模型中，利用活菌对乳酸菌进行根尖刺激，以评估其益生菌特性。随后，类似的模型被用来研究微生物BEVs作为免疫反应的调节剂。在此背景下，我们研究了益生菌EcN和共生大肠杆菌BEVs在Caco-2/外周血单个核细胞(PBMCs)共培养作为模拟完整肠黏膜模型的根尖刺激后，BEVs的免疫调节作用。作为比较，直接刺激PBMCs作为肠屏障破坏模型。分析了基底外侧腔室中几种细胞因子和趋化因子的分泌，并评估了它们在Caco-2细胞和PBMCs中的表达。尽管BEVs和细菌裂解液都能激活按屏障破坏模型处理的PBMCs中IL-6、IL-8、TNF-α、IL-10和MIP1α的表达，但在共培养模型中，只有BEVs能诱导免疫调节作用。这证明Caco-2细胞形成的上皮屏障阻止了细菌效应分子直接接触到基础PBMCs，而且PBMCs被上皮细胞分泌的因子激活，以响应BEVs。这项研究表明微生物群衍生的BEVs能够通过肠上皮屏障触发信号事件。在人结肠组织中，BEVs能上调这些细胞因子的表达。其他免疫介质的表达分析也在这个体外模型中进行了探讨。如上所述(第4.2节)，来自EcN和共生ECOR12的BEVs在这个体外模型中激活了肠屏障效应因子(如IL-22和抗菌肽β-防御素-2)的表达。相反，来自这些菌株的BEVs触发了TGF-β和促炎细胞因子IL-12的下调。TGF-β是一种多效性细胞因子，在炎症反应中具有相关调节作用。这种细胞因子引发Treg细胞的分化，具有抗炎特性。然而，在IL-6存在下，TGF-β促进了促炎性Th17。这些表型的不平衡导致Th17细胞的过度产生可能导致炎症性疾病的发展，包括IBD。在这种情况下，由这些微生物菌株的BEVs引起的TGF-β水平的降低可能有助于恢复炎症条件下的Th17/Treg平衡。Th17细胞也影响结肠细胞黏蛋白-1的分泌。我们发现，来自EcN和ECOR12的BEVs触发了结肠组织中这种膜相关粘蛋白的下调。粘蛋白-1和转化生长因子-β在多种癌症中高表达。某些肠道有益细菌对这些标志物的调节可能反映微生物BEVs对癌症进展或治疗效果的影响。总之，这些发现支持微生物群来源的BEVs在通过肠上皮屏障激活免疫和防御反应中的作用。这证明BEVs是肠道细菌与肠黏膜细胞进行通讯和调节肠道内稳态的有效策略。除了体外模型，益生菌EcN的有益特性已经在结肠炎小鼠模型中得到证实。口服给药对经DSS处理的小鼠结肠炎症状、组织学评分、肠道通透性和炎症反应的改善作用与活益生菌相同。除了抵消组织修复和伤口愈合标志物的表达改变，EcN MVs介导了抗炎作用。BEVs降低了升高的促炎细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-12、IL-17和INF-γ的表达，增加了抗炎细胞因子IL-10的表达。这种有益作用还与与损伤和炎症相关的酶的下调有关，如环氧化酶-2和诱导型一氧化氮合酶。与嗜粘蛋白艾克曼氏菌BEVs一样，益生菌EcN的囊泡可能是一种安全的益生菌衍生策略，通过靶向肠道炎症过程来保护胃肠道健康。有证据表明，来自革兰氏阳性细菌的BEVs对内皮细胞具有免疫调节作用。Kefir衍生菌株Lactobacillus kefir、Lactobacillus
kefiranofaciens和Lactobacillus kefirgranum在体外和体内炎症条件下减轻炎症细胞因子的产生。用从这些菌株分离的BEVs处理TNF-α刺激Caco-2细胞，在mRNA和蛋白分泌水平上显著减少了促炎细胞因子IL-8的产生。机制涉及通过减少NF-kBp65亚基磷酸化来抑制TNF-α信号通路。在小鼠实验性结肠炎模型中，给予Kefir乳杆菌衍生的BEVs可减轻疾病症状和组织损伤评分。这些囊泡还减少了炎症性疾病相关的氧化应激，因为用BEVs治疗的小鼠血清中髓过氧化物酶水平显著降低。有证据表明NOD受体参与了由BEVs激活的内皮细胞启动先天免疫反应的分子机制和信号通路。这些胞浆受体对维持肠道内稳态至关重要。它们在宿主对细菌病原体的防御反应和调节对微生物群的炎症反应中发挥相关作用。NOD1检测主要存在于革兰氏阴性细菌肽聚糖中的D-glutamyl-meso-diaminopimelic acid。NOD2能检测到普遍存在于所有细菌肽聚糖分子中的胞壁酰二肽。鉴于肠道微生物群主要由非侵袭性细菌组成，人们提出了几种途径介导肽聚糖进入内皮细胞。细菌分裂时释放到肠腔的肽聚糖片段可以通过内吞作用或特定的膜相关转运蛋白内化到IECs中。另一种途径主要是研究革兰氏阴性病原体，涉及通过BEVs传递肽聚糖。在益生菌和共生大肠杆菌菌株中，研究了肠道菌群的BEVs对NOD受体的激活作用。上述研究发现，从益生菌EcN和共生菌ECOR12中分离的BEVs激活了内皮细胞中NOD1信号通路。一些实验方法被用来证实这种细胞溶素受体参与细胞对内化的BEVs的反应。这些方法包括使用特异性siRNA沉默NOD1，以及使用NOD1通路特异性激酶的抑制剂。这两种方法均能显著阻断囊泡介导的NF-κB活化，从而降低IL-6和IL-8的表达。此外，来自两个微生物菌株的BEVs与NOD1在早期核内体中共定位。与NOD1的相互作用导致NOD在细胞质中形成聚集体，随后RIP2激酶的招募启动磷酸化级联，导致NF-κB活化。这种转录因子激活炎症反应中涉及的基因，通过释放趋化因子和其他免疫效应物传递到肠道常驻免疫细胞。这项研究证明肠道有益菌的EVs是肽聚糖传递到宿主细胞质的一种机制。在IECs中，微生物群BEVs对NOD受体的持续刺激可以稳定地启动先天免疫系统，导致控制炎症反应，帮助根除病原体和肠道内稳态。为了维持肠道平衡，免疫系统必须对外部抗原作出反应，并触发免疫反应，以保护宿主免受病原体或伤害。肠道微生物群和宿主黏膜免疫系统相互作用强烈，对人类健康具有重要意义。如上所述，肠道上皮是微生物向免疫细胞传递信号的间接传递者。然而，肠道相关淋巴组织的特化细胞，如树突状细胞(DCs)，可以直接与肠道微生物相互作用，并指导适当的免疫反应。因此，DCs通过协调宿主对肠道微生物的免疫反应，在连接先天反应和适应性反应中发挥相关作用，确保肠道内稳态。正如第4.1节所提到的，在食物代谢和肠道生态中，脆弱拟杆菌是肠道共生菌和众所周知的具有益生活性的菌株。在实验性结肠炎模型中证实了该菌株的免疫调节作用。灌胃脆弱拟杆菌可通过抑制炎症分子的活性和诱导抗炎细胞因子的产生来预防结肠炎的发展。第一个证明共生细菌BEVs有益作用的研究集中在脆弱拟杆菌。研究者发现脆弱拟杆菌的BEVs中含有荚膜多糖A(PSA)。在小鼠结肠炎模型中，用野生脆弱拟杆菌(BEVs)治疗的动物与用PSA缺陷突变型BEVs治疗的动物相比，疾病评分和症状得到改善。在分子机制方面，BEVs中PSA的含量与Treg细胞的活化有很强的相关性。这一点在体外模型中得到了证实，即骨髓源DCs与脆弱拟杆菌的BEVs，然后与naïve
T细胞共同培养。用野生型BEVs刺激的DCs可以增加CD4 CD25 FOXP3 T细胞数量和IL-10的产生，而用PSA突变株BEVs刺激的DCs则不能。这些免疫调节作用是通过PSA在DCs中激活TLR2通路而实现的。通过微阵列分析比较野生型BEVs或ΔPSA BEVs诱导的DCs的mRNA水平，可以鉴定出通过TLR2依赖性方式受PSA调节的基因。另一项研究表明，除TLR2之外的免疫受体参与了脆弱拟杆菌BEVs在DCs中激活的信号传导事件。这项研究关注克罗恩病(CD)的风险基因。CD4 T细胞与野生型、ATG16l1缺陷型或NOD2/敲除型小鼠共培养结果表明，BEVs的免疫调节作用依赖于功能性ATG16l1和NOD2诱导的非典型自噬途径，这种途径对结肠炎的防治至关重要。事实上，ATG16l1缺陷的DCs并没有引起Tregs对BEVs的反应。进一步的分析表明，脆弱拟杆菌利用非典型自噬途径LAP介导耐受性反应。同样，NOD2敲除的骨髓来源DCs未能通过减少IL-10的产生诱导Treg反应，这反过来削弱了对粘膜炎症的抑制。该研究还表明，来自与CD发病高风险相关的ATG16L1的T300A变体的人体免疫细胞在脆弱拟杆菌BEVs的Treg反应中存在缺陷。多形拟杆菌的免疫调节特性已在用活菌悬浮液治疗的CD临床前模型中得到证明。BEVs在介导免疫调节作用中的作用最近在一项研究中得到证实，该研究在源自健康个体和CD或溃疡性结肠炎(UC)患者的DCs中使用多形拟杆菌BEVs刺激。BEVs可诱导正常结肠树突状细胞表达IL-10，可作为健康状态的指标。其中髓系CD11 DCs最多。在来源于健康供体外周血单个核细胞的DCs中，BEVs还激活了共刺激标志物CD80和IL-6的表达。与此相反，多形拟杆菌BEVs未能诱导IBD患者结肠DCs IL-10。这与CD103 (DCs)数量减少相关。疾病的活动性也影响IBD的调节反应。在此背景下，这项研究表明，来自非活性和活动性UC患者的血源来源DCs表现出IL-10水平的变化。非活动性疾病患者的树突状细胞IL-10水平降低。相反，来自活动性疾病患者的DCs表现出与健康对照组相当的IL-10水平。这表明对这种共生体的免疫反应的内在改变在IBD中很重要。这项研究表明，来自多形拟杆菌的BEVs可以促进健康个体对微生物群的平衡免疫反应。然而，这种反应在IBD状态下改变，从而导致肠道内的炎症环境。普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)mpk是拟杆菌科的另一种肠道共生菌，具有赋予免疫调节特性的相关特征。事实上，这种共生体改善了几种IBD小鼠模型的结肠炎。普通拟杆菌mpk诱导有益免疫调节作用的机制尚未完全确定，但最近的一项研究表明，分泌的BEVs诱导骨髓源性DCs产生耐受的半成熟表型。值得注意的是，普通拟杆菌BEVs对CD11c DCs产生了与活体共生体相同的免疫调节反应，因为无论是普通拟杆菌mpk刺激的DCs还是分离的BEVs刺激的DCs，其MHC-II、CD40、CD80和CD86标志物的表达水平均无差异。以toll样受体2(Tlr2-/-)、Tlr4-4(Tlr4-/-)或两者兼有的toll样受体(Tlr2-/-和Tlr4-/-)缺失小鼠的DCs为模型，探讨BEVs介导的作用机制。这两种受体的缺失都影响了囊泡抗原的识别，并随后将未成熟的DCs转化为半成熟状态，这与MHC-II和TNF-α的表达减少有关。作者认为，普通拟杆菌mpk BEVs中的TLR-2和TLR-4配体的存在可能通过使宿主对内毒素的刺激脱敏而促进DCs的耐受。然而，然而，这一共生体中包含的BEVs中的TLR2配体的性质仍不清楚。如前所述，益生菌胞外蛋白具有许多有益的作用，有助于肠道内稳态和微生物群平衡。许多研究已经阐明了这种益生菌的免疫调节和屏障增强作用的机制和分子因素。在前面的章节中，我们回顾了由EcN菌BEVs激活的机制，这些机制提供了对IBD的保护，并强调了它们在IECS中作为肠屏障完整性和免疫反应调节剂的作用。本节描述了目前关于EcN和其他肠道驻留大肠杆菌对DCs和衍生免疫反应的免疫调节作用的知识。科学家们的研究结果表明，来自EcN菌和共生大肠杆菌菌株的BEVs能够以菌株特异性的方式激活DCs，促进T细胞亚群的分化。BEVs均显著增加Th反应细胞因子的分泌：INF-γ、IL-12、IL-18(Th1)、IL-6、IL-23、TNF-α、IL-1β(Th17/Th22)、IL-10和TGF-β(Treg)。EcN和ECOR63的囊泡比ECOR12或细胞毒性ECOR53的BEVs更能诱导Th1极化细胞因子的分泌。相反，ECOR12 BEVs诱导了高水平的Treg相关细胞因子。在体外共培养的DC/CD4 T细胞模型中，我们评估了活化的DCs对CD4 T细胞活化的差异作用。特异性T细胞标志物的细胞因子定量和细胞计数分析证明，来自所有菌株的BEVs通过释放IL-4、IL-5和IL-13激活Th2应答。与其他菌株的BEVs相比，ECOR12的BEVs诱导了较强的Treg反应，其TGF-β水平较高，促炎细胞因子表达较低。这项研究表明，在肠道中，微生物菌株释放的BEVs通过特异性激活DCs稳定启动先天免疫系统，进而协调平衡的免疫耐受和免疫炎症反应，这些反应对于保持肠道内环境稳态至关重要。与EcN的有益作用相一致，益生菌产生的BEVs驱动Th反应：Th2(对胞外寄生虫和过敏性炎症反应的免疫)、Th22(组织保护)、Th1(促炎症，对病原体的保护性免疫)、Th17(促炎症，抗微生物反应)和Treg(免疫耐受)反应。其他共生B2大肠杆菌菌株触发类似的Th反应，但具有更强的促炎作用。相比之下，ECOR12 BEVs主要通过增加Treg/Th17平衡来促进宿主对肠道微生物的耐受，并通过激活Th22反应来保护肠道完整性。然而，它们不能触发针对病原体的适当Th1反应。微生物源性BEVs利用调控机制特异性激活DCs引发适当T细胞应答是复杂的，尚未完全阐明。与BEVs激活的信号通路相关的几个分子参与调节细胞因子和共刺激分子，导致DCs具有不同的激活特性。在这种情况下，miRNAs作为免疫系统的转录后调节因子具有相关的作用，可以微调信号通路。在这项研究中，进行了深度RNA测序，以确定差异表达的DCs与来自EcN或ECOR12的BEVs。这项研究揭示了来自两个菌株的BEVs调节的一组共同的miRNA。此外，BEVs因生产菌株不同而引起特定miRNA的差异表达(EcN BEVs下调21个，上调21个；ECOR12 BEVs下调45个，上调41个)。MiRNA及其靶标的差异表达与这些BEVs对DCs的作用一致。这些效应与ECOR12 BEVs驱动DCs协调T调节反应的能力是一致的，这对肠道的免疫耐受至关重要。因此，微生物群BEVs对miRNA的差异调节通过免疫训练来维持肠道内稳态。革兰氏阳性益生菌：乳杆菌属和双歧杆菌。迄今为止，大多数被记录为益生菌的微生物是革兰氏阳性菌。其中，乳杆菌属和双歧杆菌属由于具有促进健康和免疫调节作用而被广泛研究和应用。活益生菌的悬浮液对免疫反应调节的影响已被广泛研究。然而，很少有研究关注它们的BEVs的益生活性。科学家们在小鼠模型上研究了鼠李糖乳杆菌BEVs的免疫调节作用。该研究证明鼠李糖乳杆菌JB-1衍生的BEVs具有与活体益生菌相同的免疫调节和神经元刺激作用。此外，体外实验表明，神经元反应的调节依赖于IECs对BEVs的反应所释放的信号。这些结果证实了IECs作为微生物群和肠粘膜下层细胞间接通讯的介质的关键作用。肠道粘膜组织分泌的IgA在调节微生物群落组成和防止肠道病原体入侵方面起着重要作用。肠道免疫细胞产生IgA是由益生乳杆菌菌株如Lactobacillus sakei subsp.
sakei NBRC15893激活的。在从小鼠Peyer氏斑中分离的细胞中进行的实验证明，介导这种效果的益生菌因子与纯化的BEVs有关。因此，通过增强IgA的表达，BEVs还可以作为肠道有益菌增强肠道屏障和调节肠道微生物组合的机制。有证据表明，双歧杆菌属的益生菌除了对结肠炎有保护作用外，还可以减轻过敏反应。双歧杆菌菌株对DCs的激活以及随后的naïveCD4 T细胞极化为效应反应在菌株之间是不同的。具体来说，益生菌Bifidobacterium bifidumLMG13195触发耐受性反应。通过对几种益生菌亚细胞组分对DCs的影响分析，证明这些作用是由BEVs特异性介导的。与B. bifidum LMG13195相似，BEVs激活DCs促进Treg细胞(FOXP3 )分化并诱导比Th1/Th17促炎细胞因子更高水平的IL-10。基于其抑制作用，作者认为这种益生菌的BEVs可能作为过敏原特异性免疫治疗的佐剂。食物过敏是由于对食物成分的免疫反应异常引起的，一些益生菌可以减轻症状和相关的炎症。在这种背景下，在一个由过敏原引起的食物过敏伴急性腹泻的小鼠模型中评估了长双歧杆菌的治疗潜力。这种益生菌可以通过减少小肠中肥大细胞的数量来改善炎症，而不会抵消Th2反应。作者发现，该活性是由Bifidobacterium longum衍生的BEVs介导的，特别是由囊泡蛋白ESBP所介导，该蛋白触发了骨髓来源的肥大细胞的凋亡。有相当多的证据表明，肠道微生物群衍生的化合物存在于血液中，可以通过身体分布，到达远端器官和组织。BEVs是共生肠道微生物群释放的因子之一。这些囊泡可以穿过上皮屏障进入下层粘膜层，并与免疫细胞(如DCs和巨噬细胞)相互作用。此外，微生物BEVs可以通过全身或淋巴循环扩散到肠外组织。这些肠道微生物群来源的BEVs如何到达远端器官的问题仍然没有得到很好的探索。然而，在肠道微生物组及其对健康和疾病的影响方面，这是一个新兴的研究领域。关于BEVs如何到达体循环的主要理论是基于肠漏的情况。扰乱肠道环境的许多因素引起肠道微生物群失衡。这种情况，被称为肠道生态失调。肠道生态失调导致上皮屏障破坏和随后细胞旁通透性增加，允许BEVs通透到血液。Tulkens等科学家研究了肠道屏障功能障碍患者体循环中肠道微生物BEVs的存在，分析了来自无屏障功能障碍的健康献血者和有明确肠道屏障功能障碍的患者。同一小组开发了一个详尽的方案，从粪便和血液样本中的真核衍生EVs中分离出BEVs。分析了分离样品中BEVs的特异性特征，如超微结构、蛋白质组含量和是否存在MAMPs。这种纯化过程保持了BEVs的完整性，适用于进一步的蛋白质组学和生化表征。然而，应该考虑特定的设置，以便根据每种体液标准化隔离和处理方案。因此，它的应用将有助于研究体液中的BEVs及其作为诊断工具的应用。循环BEVs的存在可以解释体液中细菌遗传物质的存在。一些研究已经报道了健康献血者血液样本中存在基因组DNA。现在人们普遍认为血液不是无菌液体，而且人体血液中的微生物组在病理条件下会发生改变。事实上，血液微生物组分析已经被认为是一种潜在的癌症诊断方法。然而，当基于序列的技术被用来研究低生物量样品中的微生物群时，避免样品处理过程中的污染是必要的。现在有大量的证据表明BEVs穿过细胞屏障并到达身体的每一个组织。其中一个例子是：来自肠道细菌的BEVs已经在健康哺乳期母亲的母乳中被检测出来。有研究证据表明，微生物BEVs也能到达大脑。这一发现可以解释为什么尽管血脑屏障具有严格的通透性，但大脑中仍然存在细菌DNA。最近关注于脑-微生物群轴的研究表明，BEVs与多种脑疾病有关，如抑郁、焦虑、压力、自闭症和阿尔茨海默氏症。在阿尔茨海默病小鼠模型中，血液中BEVs的16S rRNA宏基因组分析使得3000多个与肠道微生物群谱相关的分类单元得以鉴定。有趣的是，与作为对照的野生型小鼠相比，具有阿兹海默病型突变小鼠在某些微生物类群上发生了重要改变。基于实验组之间显著的统计差异，科学家们建议血液BEVs的宏基因组学分析可以用于鉴定与特定疾病相关的肠道微生物群失衡。同样，在患有自闭症的人群中，从尿液样本中分离出来的BEVs的基因组与健康对照组相比有很大的差异。这些差异也反映了先前在自闭症中表征的肠道微生物组的变化，从而支持BEVs在体液中用于诊断目的的潜在应用价值。
图5 微生物来源BEVs跨肠上皮转运的机制。不同过程用不同编号并用红色表示。肠道微生物释放的BEVs通过内吞作用被肠上皮细胞(IECs)吸收。内化的BEVs可以到达IECs的基底外侧膜，并通过胞吞作用进入固有层。此外，细胞旁路途径(3)也允许管腔BEVs通过下层黏膜下层。一旦进入固有层，易位的BEVs直接与常驻肠道免疫细胞相互作用，触发适当的免疫反应。有证据表明，BEVs穿过内皮屏障到达血管，从而分布到远端器官。大量关于这一主题的出版物、专门会议和论坛都强调了微生物群研究的相关性。尽管在这一领域有着大量的研究，但是关于微生物群相互作用的内在机制，特别是那些关于向靶细胞传递效应物的内在机制仍然有许多未知。这些知识对于了解疾病和开发微生物群或微生物衍生产品对人类健康的转化策略至关重要。在这种背景下，微生物BEVs的研究目前正受到越来越多的关注。来自动物模型临床前试验的证据表明，BEVs可能作为预防肠道感染或炎症和免疫相关疾病的治疗/营养策略。使用分离的BEVs将可能克服在免疫缺陷个体中使用活益生菌的潜在风险。肠道微生物群组成和多样性的失衡与包括癌症、神经、代谢和免疫紊乱在内的多种疾病有关。在这种背景下，肠道微生物组分析被认为是一种潜在的、有用的诊断工具。在患者和健康人群的血液和尿液样本中发现了肠道微生物群来源的BEVs，其特征与肠道微生物组高度相关，这为诊断提供了新的策略。微生物源EVs的研究正在迅速发展。预计在不久的将来，这一领域的研究将有助于了解复杂的微生物群-宿主通讯网络，这对于保护人类健康至关重要，并为推动基于肠道有益菌作为后生元的EVs的新治疗策略奠定坚实的基础。
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